帕金森病患者外周血中颗粒酶B和穿孔素的表达及临床意义

裴斐菲，孟新玲，王 丹，蒋 森，高慈航，杨新玲

(新疆医科大学1第二临床医学院(第二附属医院神经内科)，乌鲁木齐 830028;2附属中医医院脑病一科，乌鲁木齐 830011;3第二附属医院神经内科，4第二附属医院检验中心，乌鲁木齐 830028)

细胞毒淋巴细胞在机体免疫损伤中发挥重要作用，主要依靠CTL和NK细胞在受到靶细胞膜抗原刺激后释放穿孔素(Pf)和颗粒酶B(Gz-B)等颗粒。Pf可在靶细胞膜上形成许多贯穿细胞的孔洞，利用胞内外的渗透压差溶解靶细胞，Gz-B经过Pf形成的小孔进入靶细胞内，介导了靶细胞的死亡[6]。本研究对PD患者及健康体检者外周血中穿孔素和颗粒酶B的表达水平进行检测，旨在探讨PD患者外周血CTL、NK细胞中穿孔素和颗粒酶B表达的变化及其临床意义，发现其在PD病程中的变化规律，从而为PD诊疗、病情评估提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2018年12月-2019年6月在新疆医科大学相关附属医院就诊，并经明确诊断为PD的患者35例为病例组，其中男性20例，女性15例。年龄49～83岁，平均(69.10±9.5)岁，病程3～10年，均符合MDS帕金森病诊断标准[7]。选择门诊同期健康体检者共35名为对照组，其中男性20名，女性15名，年龄43～79岁，平均(67.54±8.44)岁，无特殊疾病史。所有受试者均签署知情同意书。病例组和对照组均排除自身免疫性疾病、肿瘤性疾病、血液病，排除正在使用对免疫系统有影响的药物及患有影响免疫系统的疾病，且外周血未见异常的炎性指标。

1.2 方法采用三色流式细胞术胞内法[8]，检测PD组及对照组外周血标本中CTL及NK细胞相关Gz-B和Pf百分比。

1.2.1 试剂 抗人CD3-PE-CY5、CD8-PE、Gz-B-FITC抗体;IC Fixation Buffer,10 ×Permeabilization Buffer；抗人CD16、CD56-PE、Pf-FITC、红细胞裂解液；同型对照抗体。

1.2.2 标记步骤 每位受试者均以肝素抗凝管采集清晨空腹静脉血，实验时PD组血样每份取等量微量全血4管，每份微量全血加入对应的细胞表面特异性分子的荧光抗体进行标记，经过红细胞裂解及离心后，每管加入固定液、穿孔液，再分别加入Gz-B-FITC、Pf-FITC抗体，经涡旋混匀、避光静置、离心等处理后，标记完成。考虑标本离体后及温度对淋巴细胞数量的影响，每份外周血样本从收集至检测完成不超过72 h。

1.2.3 检测 采用流式细胞仪进行检测，每个样品收集8 000～12 000个细胞。分别分析NK细胞及CTL细胞相关的穿孔素及颗粒酶B表达程度。

1.2.4 分级、分型标准 采用临床较常用的Hoehn-Yahr(H-Y)分级量表，以患者疾病演变及症状轻重为依据，将疾病演变分为5个阶段：1级：单侧肢体疾病(3人)；1.5级：单侧肢体合并躯干(轴)症状(6人)；2级：双侧肢体症状但无平衡障碍(9人)；2.5级:轻度双侧肢体症状，能从后拉测试中恢复(8人)；3级：轻至中度双侧症状，不能从后拉测试中恢复，姿势不稳，转弯变慢，许多功能受到限制，但能自理(7人)；4级：重度病残，不需要帮助仍能站立和行走(2人)；5级：坐轮椅或卧床，完全依赖别人帮助(0人)。根据UPDRS评分计算病例组患者震颤得分及姿势异常及步态障碍得分，将病例组患者分为按其运动障碍分为2个亚型:震颤型PD(TD)、姿势平衡障碍型(PIGD)。进一步分析帕金森病患者CTL及NK细胞Gz-B和Pf表达是否与其病情严重程度及运动障碍分型有关。

2 结果

2.1 病例组与对照组外周血CTL和NK细胞中Gz-B及Pf的表达情况病例组患者外周血中CTL和NK细胞中Gz-B和Pf的表达水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 病例组与对照组外周血CTL和NK细胞中Gz-B及Pf的表达情况

2.2 不同运动分型的PD患者CTL、NK细胞中Gz-B及Pf表达情况病例组中震颤型与姿势平衡障碍型患者外周血CTL、NK细胞中Gz-B和Pf表达差异无统计学意义(P均>0.05)，见表2。

表2 不同运动分型的PD患者CTL、NK细胞中Gz-B及Pf表达情况

2.3 CTL、NK细胞中Gz-B及Pf表达情况与H-Y评分、病程的相关性CTL细胞中Gz-B的表达与患者病情严重程度和病程时间呈正相关，差异具有统计学意义(P<0.05)。而CTL-Pf，NK-Gz-B，NK-Pf表达百分比与患者病情严重程度和病程时间长短无关，见表3。

表3 CTL、NK细胞中Gz-B及Pf表达情况与H-Y评分、病程的相关性

3 讨论

PD作为常见的神经系统退行性病变，临床表现复杂多变，为运动症状与非运动症状的结合，病情进行性加重，后期患者常因平衡障碍、吞咽困难和长期卧床致褥疮形成、坠积性肺炎等导致生活质量严重下降，预后较差。PD患者尸检结果揭示了其重要的病理特征：黑质内残存的多巴胺能神经元胞体内有路易小体形成，其主要成分是α-突触核蛋白(α-syn)[9]。多巴胺能神经元的病理变化导致黑质纹状体通路破坏及尾状核、壳核中多巴胺含量减少，通常患者就诊时，其多巴胺能神经元的损失已达到50%以上[10]。

Schapansky等[11]研究提示，α-syn可以诱导小胶质细胞的活化，从而介导神经炎症的产生，导致多巴胺能神经元损伤及促进了慢性神经变性的进展，也有研究认为全身系统性炎症反应导致促炎分子、外周血中T淋巴细胞亚群透过血脑屏障进入脑组织中激活小胶质细胞[12]，产生大量细胞毒性分子，包括NO、ROS等，促进了PD的病理过程。这些研究都符合了PD尸检病理中发现其黑质部有小胶质细胞表达及与细胞死亡相关的T淋巴细胞的浸润，同时也有实验证明PD模型鼠黑质处有T淋巴细胞聚集[13]。故近年来从免疫角度研究PD中脑神经元变性的过程及相关动物实验和临床研究逐渐增多，以期能有效干预脑内发生的慢性炎症反应，抑制神经元的损伤，延缓病情的进展。

研究发现PD患者较健康个体对比，淋巴细胞中确实存在增强的细胞凋亡信号。在机体的免疫系统中，NK细胞为具有天生杀伤能力的细胞，不依赖抗体参与人体固有免疫的重要环节，它在抑制病毒感染、抑制肿瘤发展等方面有独特作用，其机制主要是通过Fas(CD95)和FasL(CD95L)相互作用，以及通过释放颗粒酶B和穿孔素而破坏靶细胞[14]。Niwa等[15]研究显示其在PD患者外周血中上升。

左丽君等[18]研究显示非震颤PD患者皮质有着更严重的路易小体沉积，且Shannon等[19]在病理研究中发现，不同运动分型的PD患者多巴胺能神经元的损伤情况不同，姿势不稳/步态障碍型PD(PIGD)多巴胺损失较重，但震颤型PD(TD)中多巴胺水平接近正常。本研究结果显示，不同运动症状分型PD患者CTL、NK细胞颗粒酶B、穿孔素表达比较，差异无统计学意义。PD运动分型方法灵活，病情进展具有演变性，暂不支持以此指标作为PD运动症状分型依据及指导治疗。也有可能因本研究样本量较小，且未作长期病情演变观察，未能突出差异，故此结论尚需进一步论证。

PD作为一种神经退行性疾病，既往研究显示其与年龄、病程、严重程度有一定相关性[20]。本研究中，仅CTL-Gz-B与PD患者的病程、病情严重程度呈正相关，因此，对PD患者外周血CTL、NK细胞颗粒酶B、穿孔素表达水平的检测尚不足以支持作为PD病情严重程度的评估指标，也暂不能指导临床治疗。

总之，T淋巴细胞杀伤功能及固有免疫异常与PD密切相关，且CTL细胞和NK细胞穿孔素及颗粒酶B高表达是造成PD多巴胺能神经元损伤的重要因素，其确切机制仍有待深入研究，可为PD的临床治疗提供一定的新思路。