古日古木-13丸剂定性鉴别及栀子苷含量测定研究

张文文，石 翠，马桂芝

(新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011)

古日古木-13丸为新疆维吾尔自治区博尔塔拉蒙古自治州蒙医院院内制剂，由红花、栀子、诃子、丁香、川楝子、西红花、麦冬、水牛角(粉)、木香、紫檀香、人工牛黄、银朱、麝香、大托叶云实14味药材组成，该方是在《中华人民共和国卫生部药品标准-蒙药分册》[1]古日古木-13原方的基础上，结合多年临床经验调整而得，性凉，为治疗肝炎、肝衰常用方。现代药理学研究表明古日古木-13丸具有抗肝损伤[2-4]、抗神经性损伤[5]等作用。方中川楝子、诃子、木香、栀子为主要药材，川楝子、诃子中主要成分为没食子酸[6]，具有抗肝纤维化作用[7-8]。木香中去氢木香内酯是一种倍半萜内酯类化合物，具有较好的抗乙型肝炎毒活性作用[9-10]。栀子含栀子苷，对心脑血管、肝胆疾病及糖尿病均有良好的干预效果[11]。作为临床应用多年的医院自制制剂，古日古木-13丸疗效明确，未见明显不良反应，但现行质量标准较为简单，主要以其性状进行产品质量判定，缺乏定性鉴别方法和定量分析手段。本研究建立了鉴别制剂中的没食子酸、去氢木香内酯的薄层色谱法，测定制剂中栀子苷的含量的HPLC法，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器LC-20AD型岛津液相色谱仪(日本岛津公司)，SPD-M20A型光电二极管阵列紫外可见光检测器(日本岛津公司)，Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，New Classic MF型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司，d=0.01 mg)，KQ500DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，Milli-Q型艾柯超纯水仪(美国密理博公司)，LINOMAT5型半自动点样仪(瑞士CAMAG公司)，EPROSTAR3型薄层色谱数码成像系统(瑞士CAMAG公司)。

1.2 试药古日古木-13丸剂(批号20171201，20180104，20180208，20180410)、木香(批号170718)、诃子(批号070308)、川楝子(批号170318)均由新疆维吾尔自治区博尔塔拉蒙古自治州蒙医医院提供。栀子苷对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号C07N7Y24406，纯度99.84%)，去氢木香内酯对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号MUST-17101311，纯度99.20%)，没食子酸对照品(中国食品药品检定研究所，批号110831-200803)，乙腈(上海西格玛奥德里奇贸易有限公司，批号WXBC8826V，色谱纯)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 古日古木-13丸中没食子酸和去氢木香内酯的薄层色谱鉴别

2.1.1 没食子酸的TLC鉴别[12-13]取古日古木-13丸，粉碎，过40目筛，取1 g粉末，置于5 mL量瓶中，加甲醇至5 mL，超声5 min，滤过，滤液即为供试品溶液。取适量没食子酸对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg没食子酸的对照品溶液。根据处方配比和制备方法，制备1g不含川楝子与诃子(没食子酸)的阴性样品，同法制得为阴性样品溶液。分别取上述供试品溶液、阴性样品溶液各8 μL和对照品溶液2 μL，点在同一硅胶G板上，用氯仿-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)作为展开剂展开，取出，喷以2%三氯化铁乙醇溶液显色，烘干，在可见光下检视。结果显示，供试品色谱图中与对照品色谱图相同的位置处显相同颜色的斑点，阴性样品色谱图中相应的位置处无斑点，见图1。

2.1.2 去氢木香内酯的TLC鉴别[14-17]取适量去氢木香内酯对照品，加入甲醇，制成每1 mL含有0.5 mg去氢木香内酯的对照品溶液。取“2.1.1”项下供试品溶液适量，按处方配比和制备方法制备1 g不含木香的阴性样品，同法制得为阴性样品溶液。分别取阴性样品溶液、供试品溶液和对照品溶液各2 μL，点在同一硅胶G板上，用环己烷-丙酮(10∶3)展开，取出，烘干，喷以5%香草醛硫酸乙醇溶液，加热直至斑点清晰，在可见光下检视。结果显示，供试品色谱图中，在与对照品色谱图相同的位置处显相同颜色的斑点，阴性样品色谱图中相应的位置处无斑点，见图2。

注：1、2、3、4分别为批号20171201、20180104、20180208、20180410古日古木-13丸样品，5为不含川楝子和诃子的阴性样品，6为没食子酸对照品。图1 古日古木-13丸中没食子酸TLC谱图

注：1、2、3、4分别为批号20171201、20180104、20180208、20180410古日古木-13丸样品，5为不含木香的阴性溶液，6为去氢木香内酯对照品。图2 古日古木-13丸中去氢木香内酯的薄层色谱图

2.2 古日古木-13丸中栀子苷的含量测定

2.2.1 色谱条件[18-19]Kromosil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱(0～25 min：A%为11%，25～35min：A%为11%→30%，35～45 min：A%为30%→11%，45～55 min：A%为11%)，流速1.0 mL/min，检测波长238 nm，柱温25℃，进样量20 μL。

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 对照品储备溶液的制备 称取栀子苷对照品适量，加50 %甲醇制成每1mL含栀子苷63.4 μg的对照品储备溶液，备用。

2.2.2.2 对照品溶液的制备 吸取对照品储备溶液适量，加50 %甲醇制成每1 mL含栀子苷7.92 μg的对照品溶液，备用。

2.2.2.3 供试品溶液 取古日古木-13丸，粉碎并过400目筛，称取1 g粉末，置于25 mL量瓶中，加20 mL 50%甲醇超声(200 W，50 kHz)40 min，定容至刻度，备用。

2.2.2.4 阴性样品溶液 按处方配比及制备方法制备不含栀子的阴性样品，按“2.2.2.3”项下操作，制备阴性样品溶液。

2.2.3 方法学考察[20]

2.2.3.1 专属性实验 取供试品溶液、对照品溶液和阴性样品溶液各20 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样。由图可见，供试品中栀子苷的色谱峰与其它色谱峰可实现基线分离，分离度大于1.5，样品中其它成分色谱峰不干扰栀子苷的测定，按栀子苷峰计算理论塔板数均不低于10 000，拖尾因子为1.009，符合色谱系统适用性的要求，见图3～5。

图3 对照品溶液HPLC色谱图(1：栀子苷)

图4 供试品溶液HPLC色谱图(1：栀子苷)

图5 阴性样品溶液HPLC色谱图

2.2.3.2线性关系考察 吸取“2.2.2.2”项下对照品储备液，以50%甲醇为溶剂，依次倍量稀释，得1.98、3.96、7.92、15.85、31.70、63.40μg/mL系列浓度对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，以峰面积(Y)与浓度(X，μg/mL)进行线性回归，得回归方程：Y=29496X-15861，r=0.9999，表明栀子苷质量浓度在1.98～63.40μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.3.3精密度实验 取供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，连续进样6次，测得峰面积并计算RSD值。结果栀子苷峰面积的RSD为1.5%，表明仪器精密度良好。

2.2.3.4稳定性实验 取“2.2.2.3”项下供试品溶液，分别在样品制备后的第0、2、4、6、8、10、12h按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积。栀子苷峰面积的RSD为1.9%，表明供试品溶液12h内稳定性良好。

2.2.3.5重复性实验 称取6份样品粉末0.1g，按“2.2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件测定，计算栀子苷含量。栀子苷含量的RSD为0.4%，表明方法重复性良好。

2.2.3.6加样回收率实验 称取6份已知栀子苷含量的样品0.1g置于25mL量瓶中，加入适量栀子苷对照品，按“2.2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积值，计算加样回收率及RSD值。平均加样回收率为101.6%，RSD为1.1%，见表1。

2.2.4样品含量测定 取4批次古日古木-13丸，按照“2.2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积值，计算栀子苷的含量。结果样品中栀子苷含量在226.50～230.38μg/g，平均含量为(228.19±1.72)μg/g，见表2。

表1 栀子苷回收率实验结果(n=6)

表2 古日古木-13丸剂中栀子苷含量测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 鉴别及定量分析中目标成分的选择预实验对制剂中人工牛黄中的猪去氧胆酸、红花的羟基红花黄色素A的薄层鉴别方法进行了研究，但结果表明牛黄的猪去氧胆酸和红花中的羟基红花黄色素A色谱斑点，与干扰成分的色谱斑点均无法实现有效分离，因此本研究选择对木香中去氢木香内酯、川楝子与诃子中没食子酸进行定性鉴别研究，对栀子中栀子苷进行HPLC含量测定研究。

3.2 去氢木香内酯的薄层色谱鉴别鉴别去氢木香内酯时，在预实验中筛选了3种展开系统，分别是环己烷-丙酮(10∶3)、环己烷-乙酸乙酯(9∶1)、石油醚-乙酸乙酯(5∶1)，最终确定以环己烷-丙酮(10∶3)为展开系统，该色谱条件下目标成分Rf值适中，斑点清晰且分离较好，耐用性考察结果表明不同厂家的薄层板、环境温湿度变化对目标成分色谱行为未产生影响。

3.3 没食子酸的薄层色谱鉴别鉴别没食子酸时，在预实验中筛选了三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)、环己烷-乙酸乙酯-甲酸-水(5∶7∶2∶3)、环己烷-乙酸乙酯-甲酸(6∶4∶0.5)3种展开系统，最终确定以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)为展开剂，该色谱条件下目标成分Rf值适中，斑点清晰且分离效果较好，耐用性考察结果表明不同厂家的薄层板、环境温湿度变化对目标成分色谱行为未产生影响。

3.4栀子苷的HPLC分析在建立测定古日古木-13丸中栀子苷含量的HPLC法时，本研究考察了乙腈-水(15∶85)、乙腈-水(11∶89)2种洗脱条件，其中乙腈-水(15∶85)作为流动相时目标峰附近有干扰峰出现，分离度较差。增大水相比例目标峰前后无干扰峰出现，提高了目标物质的分离度，但该系统等度洗脱至120 min时色谱图中仍有色谱峰出现，故本实验采用乙腈(A)-水(B)梯度洗脱，色谱图中栀子苷与干扰峰完全分离，分离效果和峰形明显改善，同时缩短了样品分析时间。

综上所述，本研究所建立的方法简便、可行、准确，符合方法学要求，可适用于古日古木-13丸的定性与定量分析。