超声微泡介导MaFGF 对阿霉素心力衰竭大鼠心功能的保护作用及其机制研究

倪贤伟 田新桥 赵应征 郑磊 李剑敏

Lefrak 于1973 年率先报道阿霉素具备心脏毒性，提出其危险性相较肾脏毒性、消化道不良反应、骨髓抑制等更高[1]。阿霉素疗法存在致心脏毒性风险，最严重的一类并发症为心力衰竭（简称心衰）。改构型酸性成纤维细胞生长因子（modified acidic fibroblast growth factor，MaFGF）是通过基因工程技术去除酸性成纤维细胞生长因子（acidic fibroblast growth factor，aFGF）促分裂活性并保留非促分裂活性的突变体[2]，与aFGF 具有同等的心肌保护效应[3]，如抵抗氧化应激、抑制心肌细胞凋亡等[4]。本研究应用超声靶向微泡击破技术（ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD）靶向介导MaFGF 对阿霉素诱导心肌损伤大鼠进行干预，采用超声心动图检查，测定心肌丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）含量，通过Masson 胶原染色及透射电镜等检查评价该方法对阿霉素心衰大鼠心功能的保护作用并探讨其机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 健康雄性SPF 级SD 大鼠共40只，鼠龄40～50d，体重（210±24）g，由温州医科大学实验动物中心提供。

1.2 实验仪器与试剂 超声诊断系统为Acuson Sequoia 512C（美国Siemens 公司），探头：15L8w-S线阵，频率：12～14MHz，内部配装RT-MCE 造影软件。MaFGF 冻干粉为温州医科大学生物和天然药物开发中心有限公司提供；微泡造影剂采用SonoVue微泡（意大利Bracco 公司）；盐酸阿霉素购自大连美仑生物有限公司；SOD 与MDA 试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司；Masson 三色染色液购自武汉谷歌生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SonoVue-MaFGF 混悬液配制 称量MaFGF冻干粉30μg，添加0.9%氧化钠溶液5ml，小幅振摇使彻底溶解，即得到MaFGF 溶液，然后移入SonoVue瓶（已含SonoVue 冻干粉）内，待混合，于室温中进行10～20min 静置孵育处理，此过程中小幅振荡若干次，最后得到SonoVue-MaFGF 混悬液[5]。参考课题组以往实验结果，此项目所制备的SonoVue-MaFGF 混悬液所含MaFGF 量控制为6μg/ml。

1.3.2 动物造模及分组 40 只SD 大鼠通过随机区组法归入以下4 组：正常对照组、HF 模型组、MaFGF组、MaFGF+UTMD 组，每组10 只。后3 组实验动物根据体重，将3mg/kg 盐酸阿霉素由腹腔注入体内，每周1 次，共6 周，注射量合计为18mg/kg，正常对照组注射等容积的0.9%氯化钠溶液。动物实验均得到温州医科大学动物伦理委员会审核通过。

1.3.3 实验处理 MaFGF+UTMD 组大鼠腹腔注入戊巴比妥钠（3%）麻醉，之后剃除心前区毛发，将探头放在其心前区，超声切面为乳头肌水平左心室短轴，设定3.5～4.0cm 聚焦深度，分别经尾静脉注射0.1ml SonoVue-MaFGF 混悬液，当数量可观的微泡充盈心肌内部时，借助设备自带微泡爆破功能对微泡实施若干次重复爆破处理，期间机械指数（MI）设定为1.9，待微泡彻底消失结束。MaFGF 组大鼠经尾静脉注入MaFGF 溶液0.1ml。正常对照组和HF 模型组大鼠尾静脉注入0.1ml 0.9%氯化钠溶液，每周分别在注入盐酸阿霉素后的第4、6 天实施上述干预，共6 周。

1.3.4 超声心动图检查 干预6 周后，各组实验动物依次接受麻醉（经腹腔注入3%戊巴比妥钠）、胸前区剃毛处理，使其呈左侧卧位，并在固定板上固定，将探头放在其心前区，行超声心动图检查，测量各组大鼠左心室收缩末期内径（LVESd）、左心室舒张末期内径（LVEDd）、左心室短轴缩短率（LVFS）以及左心室射血分数（LVEF）。

1.3.5 MDA、SOD 水平测定 处死大鼠后，取部分大鼠左心室心肌组织，加入冷0.9%氯化钠溶液，使0.9%氯化钠溶液总体积：心肌组织重量为9∶1（1g可换算为1ml），借助眼科小剪刀迅速剪碎组织块，接着于碎冰内对组织实施研磨。对完成配制10%组织匀浆实施10min 离心处理，3 000r/min、4℃，取适量上清液待检测。采用BCA 试剂盒测定心肌总蛋白含量，根据MDA、SOD 两试剂盒所示操作测定心肌组织MDA 和SOD 水平。

1.3.6 Masson 胶原染色 收集大鼠心脏组织，接着实施1d 固定（固定液为4%多聚甲醛），之后石蜡包埋，切片（厚度为5μm），进行Masson 胶原染色，置于高分辨率光学显微镜下观察心肌纤维化状况，各组12 张切片，随机选择各切片内20 个400 倍视野，应用IPP 6.0 软件测量心肌胶原容积分数（CVF）、血管周围胶原面积（PVCA）/血管腔面积（LA）比值。

1.3.7 透射电镜观察 大鼠心肌组织采用锇酸固定，丙酮梯度脱水（70%、80%、90%），环氧树脂浸透包埋、聚合，通过超薄切片机得到超薄切片，通过透射电镜观察心肌细胞超微结构。

1.4 统计学处理 采用SPSS20.0 统计软件，计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），方差齐性者两两比较采用LSD-t检验，方差不齐者进行Dunnet’sT检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠超声心动图检查结果比较 见表1。

表1 各组大鼠超声心动图检查结果比较

由表1 可见，HF 模型组LVESd、LVEDd 较正常对照组升高，LVEF、LVFS 则降低（均P＜0.05）；经过6 周干预，MaFGF 组、MaFGF+UTMD 组LVEF、LVFS较HF 模型组均升高，LVESd、LVEDd 则降低（均P＜0.05）；MaFGF+UTMD 组LVEF、LVFS 较MaFGF组均升高（均P＜0.05）。

2.2 各组大鼠心肌组织MDA、SOD 水平比较 见表2。

表2 各组大鼠心肌组织MDA、SOD 水平比较

由表2 可见，HF 模型组心肌组织SOD 水平较正常对照组降低，MDA 则升高（均P＜0.05），MaFGF组及MaFGF+UTMD 组心肌组织MDA 水平较HF模型组下降、SOD 则升高（均P＜0.05）。与MaFGF组相比，MaFGF+UTMD 组心肌组织SOD 水平升高（P＜0.05）。

2.3 各组大鼠心肌组织Masson 胶原染色结果 见插页图1、2 及表3。

表3 各组大鼠心肌组织CVF 与PVCA/LA 比较

由插页图1、2 可见，红细胞、纤维束与肌纤维均显红色，心肌胶原纤维则显蓝色。与正常对照组比较，HF 模型组CVF、PVCA/LA 均升高（均P＜0.05），MaFGF 及MaFGF+UTMD 组心肌组织CVF 和PVCA/LA 较HF 模型组下降（均P＜0.05），而与MaFGF 组相比，MaFGF+UTMD 组心肌组织CVF 和PVCA/LA 下降更明显（均P＜0.05）。

2.4 各组大鼠心肌组织透射电镜检测结果 见图3。

图3 各组大鼠心肌组织透射电镜结果（A：正常对照组；B：HF 模型组；C：MaFGF 组；D：MaFGF+UTMD 组；×10 000）

由图3 可见，正常对照组各肌丝分布整齐，未见异常线粒体形态，为单行分布，附近无明显空泡产生。与正常对照组比较，HF 模型组经6 周干预，心肌各肌丝分布丧失齐整性，且线粒体无规律分布，肿胀变形，附近存在空泡；但是经过6 周MaFGF 干预，心脏微观逐渐好转，尤其MaFGF+UTMD 组心脏肌丝与肌纤维分布较为整齐，未见异常线粒体形态，且规则分布，肌丝附近空泡量大幅下降。

3 讨论

心衰是阿霉素疗法危险性最大的一类并发症，临床虽有包括心脏移植、支持治疗在内的若干治疗方案，但心衰患者无法得到良好预后，且存在较高致死率。而由盐酸阿霉素诱导的心衰发生的具体发病机制还未完全阐明，现今认为是由诸多因素（包括氧化应激、溶酶体改变、炎性反应、心肌电解质紊乱等）协同作用所致[6]。然而，由氧自由基（oxygen free radical，OFR）产生所致氧化应激提升一直被视作阿霉素导致心衰的关键环节[6]。因此，减少氧自由基产生和抗氧化应激治疗成为防治心衰的重要策略。

已有研究发现，aFGF 高表达于心脏组织，在心脏发育、心肌细胞凋亡受抑、增强心肌细胞增生分化、抗氧化应激、促心肌毛细血管产生[7]等方面发挥一定作用，所以，在治疗心脏病变方面应用aFGF 具备潜在价值。然而鉴于在促有丝分裂方面的广谱性特征，aFGF 促进正常细胞有序增殖的同时也诱导肿瘤细胞和肿瘤干细胞大量增殖。借助基因工程技术，MaFGF 是能够消除aFGF 促分裂性能，同时将无促分裂能力留存下来的突变体[2]，发挥与aFGF 等效的心肌保护作用[3]，还可在一定程度上避免不良反应的发生。但MaFGF 分子量很大，稳定性较差，在体外存在极大氧化失活风险，全身给药被快速灭活，因此半衰期短，生物利用率不高，同时不具备可控性、安全性与高效性的心肌靶向传输载体和技术，采取直接心肌注射MaFGF 法，在操作复杂性、有创性等方面有所不足，使得其临床应用受限。

将超声微泡当作造影剂对靶向组织实施超声显影，受到治疗或诊断性超声波能量刺激，超声微泡爆破所致空化效应与机械作用可使暂时性开放小孔见于局部内皮细胞膜和毛细血管上[8-9]，经由此类小孔，药物能够向组织内转移，实现靶向输送药物的目的。此次研究在配制SonoVue-MaFGF 基础上，超声能量作用下于心肌组织对SonoVue-MaFGF 施以靶向爆破处理，由此完成MaFGF 向心肌组织的输送，并释放效能。通过超声心动图检测发现，HF 模型组LVESd、LVEDd 均较对照组显著升高，而LVEF、LVFS 则明显降低；接受了6 周MaFGF 靶向干预后，相比HF 模型组，MaFGF+UTMD 组LVFS、LVEF 明显升高，LVESd、LVEDd 则明显下降。可见阿霉素的心肌毒性可导致实验动物心腔大幅扩张，明显损伤左心室收缩功能，同时由UTMD 介导的MaFGF 对于心衰大鼠左心室收缩功能可发挥积极的保护效应。心肌组织SOD、MDA 水平测定结果显示，MaFGF组与MaFGF+UTMD 组SOD 明显升高，但MDA 明显降低，证实MaFGF 干预可有效抵抗由阿霉素所致的氧化应激反应。线粒体是活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要供体以及作用靶点[10]，相比其它器官，作为能量需求高的脏器，心脏线粒体数量与密度较高，所以更易受到阿霉素所致氧化应激反应的攻击。透射电镜结果显示，相较于正常对照组大鼠，HF 模型组大鼠的心肌肌丝之间排列紊乱，同时线粒体排列紊乱，肿胀变形，周围可见空泡形成，说明HF 模型组大鼠心脏结构明显异常以及能量代谢紊乱，而分布紊乱与肿胀的线粒体经过MaFGF+UTMD干预，出现明显好转，与心肌SOD 与MDA 检测结果相符，更加证实了MaFGF 使阿霉素所致氧化应激反应受抑的机制可能为抑制ROS 靶向刺激线粒体膜。经Masson 胶原染色发现，HF 模型组大鼠心肌间与血管附近含胶原纤维量大幅上升，可见阿霉素心肌毒性能够导致心肌间质与血管周围纤维化的发生，经过MaFGF+UTMD 干预，心肌胶原统计结果显示，CVF 与PVCA/LA 明显下降。

综上所述，本研究证实阿霉素心肌毒性能够明显提高心肌氧化应激水平，使得心衰大鼠产生明显心肌纤维化现象，而心肌纤维化可导致心室壁僵硬，顺应性减弱，心室腔明显扩大，由此导致心功能明显减低。MaFGF 具备抗氧化应激功能[3，11]，携载MaFGF 的超声微泡与UTMD 技术联合应用，能够对阿霉素诱导的心肌损伤发挥积极的防治作用，对心衰大鼠左心室收缩功能具有保护作用，分析其机制可能与MaFGF 减轻ROS 损伤心肌线粒体膜程度，增强心肌抗氧化功能，使氧化应激反应受抑并抑制心肌纤维化相关。