高尿素促进心肌细胞发生脂质代谢紊乱的实验研究

于兰英 刘恬恬 付双 刘晟 舒楠淇 杜艳伟 孟艳

尿素是哺乳动物蛋白质分解代谢的主要终末产物，具有高水溶性及低脂溶性，在肝脏内合成并浓缩在哺乳动物的肾脏中。尿素在哺乳动物肝脏内合成的过程，被称为尿素循环，为哺乳动物生命活动必须环节。尿素循环的主要目的是合成组织细胞活动所需的一氧化氮和多胺等，并在这个过程中催化精氨酸转变为鸟氨酸。研究人员在哺乳动物的心脏中也发现了部分尿素循环，有实验表明小鼠心肌细胞内尿素的堆积能促使小鼠发生心肌肥大。本研究拟利用心肌细胞（H9C2）建立高尿素模型，探讨高尿素对心肌细胞脂质代谢的影响，现将研究结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料 H9C2 细胞由上海拜力生物科技有限公司提供，DMEM 高糖基础培养基、胎牛血清由美国Gibco 公司提供，蛋白裂解液由美国Sigma 公司提供，RIPA 缓冲液由美国Boston BioProducts 公司提供，BCA 蛋白质测定试剂盒、ECL 显色液由美国赛默飞世尔科技提供，心房利钠尿多肽（atrial natriuretic polypeptide，ANP）一抗、β-actin 抗体、羊抗兔IgG 二抗（北京博奥森公司，产品编号：bs-2040R、bs-0061R、bs-0295G），PVDF 膜（美国Millipore 公司），油红O 染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），总胆固醇（TCH 酶法）测试盒、甘油三酯（TG 酶法）测试盒、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 H9C2 细胞用含10%胎牛血清、100U/ml 青霉素以及0.1mg/ml 链霉素的高糖DMEM培养基，置于37℃、5% CO2细胞培养箱进行孵育。在本项实验中，取对数生长期的H9C2 细胞进行铺板，使各皿内细胞密度相等，24h 后模型组加入20mM 尿素，对照组加入1%磷酸盐缓冲液（phosphate buffer，PBS），继续培养。处理后分别于24、48及72h 提取细胞蛋白并用于后续实验。

1.2.2 H9C2 细胞ANP 表达水平检测 采用蛋白免疫印迹法检测心肌细胞ANP 表达水平。收取H9C2细胞，在含有蛋白酶抑制剂的RIPA 缓冲液中裂解。通过离心获得上清液，抽取出的蛋白使用BCA 蛋白质测定试剂盒测定浓度，根据标准曲线进行蛋白定量。用12%SDS-PAGE 凝胶分离等量的蛋白质样品，并转到PVDF 膜上。在室温下，将膜在5%脱脂牛奶中封闭1h，并在4℃下与适当浓度的一抗孵育过夜。次日用TBST 洗膜3 次后加入适当浓度稀释的二抗，室温下继续孵育1h 后将膜用TBST 洗涤3次，加入ECL 显色液进行显色，记录实验结果，使用图像分析软件（Image J）分析条带的密度。

1.2.3 H9C2 细胞内脂滴堆积状态观测 通过油红O 染色方法，观察心肌细胞内脂滴堆积状态。分别取对照组与24、48、72h 的模型组细胞进行观察。移除细胞培养基，用PBS 清洗细胞后用60%异丙醇固定，加入油红染料对细胞内脂滴进行染色，后加入Mayer 苏木素染色液对细胞核进行复染，弃去染色液，加入蒸馏水覆盖细胞并在倒置显微镜（日本Olympus 公司）下进行观察，拍照。

1.2.4 H9C2 细胞内脂类含量测定 采用德国奥芬堡FLUOstar Omega 酶标仪检测细胞内脂类含量。分别取对照组与24、48、72h 的模型组细胞进行观察。采用含有蛋白酶抑制剂的RIPA 缓冲液中进行细胞裂解，冰水浴条件下超声破碎，制备好的匀浆液不离心，直接吸取加入96 孔板，总胆固醇、甘油三酯于510nm 波长测定，HDL-C、LDL-C 于570nm 波长测定。所剩匀浆进行BCA 蛋白定量。最终结合测定结果与BCA 定量结果计算细胞内各脂类含量。所得数据使用GraphPad 进行处理，并绘制柱形图。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0 统计软件，符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，各组内均数比较采用post hoc 分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H9C2 细胞ANP 表达水平比较 见图1。

图1 H9C2 细胞ANP 表达水平比较（注：*P＜0.05）

由图1 可见，与对照组比较，模型组心肌细胞ANP 表达水平显著增高，且随时间呈上升趋势，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.2 H9C2 细胞内脂滴堆积状态 见图2。

由图2 可见，与对照组比较，24h 模型组心肌细胞内出现大量脂滴。

2.3 H9C2 细胞内脂类含量变化 见图3。

由图3 可见，与对照组比较，模型组心肌细胞总胆固醇、甘油三酯，HDL-C、LDL-C 含量均明显增高，组内比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

图2 H9C2 细胞内脂滴堆积状态（A：对照组；B：24h 模型组；油红O染色，×400）

图3 H9C2 细胞内各类脂质含量

3 讨论

心肌肥大作为心脏的一种强而有力的代偿形式，是心脏疾病进展的主要预后因子之一，临床上常常将其与高血压、心力衰竭以及缺血性心脏病等多种心脏疾病相联系，长期心肌肥大增加了心脏衰竭和猝死的危险性[1-4]。到目前为止，人们主要将神经-内分泌系统的过度活化作为心肌肥大和心力衰竭预防与治疗的靶点，临床上血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）、β 受体阻滞剂以及醛固酮拮抗剂也被广泛应用到疾病治疗的过程中，这些治疗手段无疑减缓了患者的痛苦及临床表现，延缓了心肌疾病的进程，但无法阻止其恶化的过程[5-6]。因此进一步探讨研究心脏疾病的机制，以制定相应的干预措施，仍然是研究人员的主要任务之一。

心脏是一个高耗能器官，通过对各种外源性底物的应用产生能量，这个过程受到底物浓度、氧的供应和心血管系统激素水平的影响，而在心脏面对各种刺激的情况下，心脏能弹性选择用于供能的底物[9]，从而保持能量功能与心脏功能的平衡。常氧条件下，心脏中的ATP 主要来自于线粒体的氧化磷酸化和糖酵解，以及对脂肪酸和葡萄糖的利用。当心肌丧失“自主”弹性选择底物的能力，对于某种特殊底物的过分依赖，会导致线粒体功能障碍，引起心肌细胞的一系列病理性变化，加速细胞生长凋亡，最后致使心肌收缩舒张功能下降。在2004 年，Van Bilsen 提出心肌代谢重构的概念，指出心脏在慢性超负荷以及底物供应改变时，出现线粒体功能失调以及高能磷酸盐代谢异常的现象[7-8]。随后又有实验证明，在心肌肥大早期及心力衰竭的失代偿期存在能量代谢障碍，在这个过程中最具特征的便是线粒体功能障碍。

尿素通道蛋白是尿素跨膜转运的蛋白，前期实验研究证明，尿素通道蛋白缺失导致小鼠心肌细胞尿素堆积。此外，尿素转运蛋白基因敲除小鼠心肌活性氧产量增高，氧化应激水平增加[9]。针对这些现象，本实验选择利用心肌细胞（H9C2 细胞）以及20mM尿素建立高尿素模型，探讨高尿素对心肌细胞脂质代谢的影响。研究结果表明，在高尿素负荷下，心肌重构标志蛋白ANP 表达水平增高，心肌细胞内发生明显的脂肪堆积，与脂肪生成和运送相关的脂类物质含量也出现增加，并且这些现象随时间呈递增趋势。这既是对之前一些研究的进一步证实，也是为之后的研究提出了思路与建议。

本次研究的实验结果暗示了高尿素可使得心肌细胞内脂质代谢异常，可促进心肌细胞发生脂质代谢紊乱，然而其具体机制仍待进一步研究证实。我们有理由相信基于此方向的心肌疾病机制研究将为临床治疗心脏疾病提供新的靶点与策略，同时也为临床开发新的不良反应更小的治疗药物提供了思路。