影像技术无创评价小鼠动脉粥样斑块模型的研究进展

张 雪，郑婷婷，彭 佼，陈 芸（通讯作者）

（北京大学深圳医院超声影像科 广东 深圳 518036）

根据《中国心血管病报告2018》发布的数据，目前中国有2.9亿心血管疾病患者，其死亡率占全国疾病致死因素之首。导致心血管疾病的病因多且复杂，其中较公认的是血管内的粥样硬化斑块累积导致血管炎症，进一步引发慢性器质性病变，最终导致血管硬化，即引发血管壁粥样硬化症，由于病变血管多发生在动脉，即将这类疾病命名为：动脉粥样硬化症（atherosclerosis, AS）[1-3]，本文主要介绍AS斑块的组织病理学特征和小鼠AS模型的应用，以及各种成像技术在小鼠AS模型中的诊断评价的最新进展。

1 AS斑块组织病理学

AS斑块显像的关键在于了解晚期粥样硬化斑块的组织病理学特征。根据美国心脏协会（AHA）在1995年制定的动脉粥样硬化斑块组织学分类标准[4]，AS病变可分为以下六型：I型，巨噬细胞和泡沫细胞的沉积；II型，脂肪条纹病变，主要是细胞内的脂质积聚；III型，斑块内细胞外的脂质沉积。这三种类型发生在斑块形成早期，通常没有临床上的表现[5-6]。IV型，也被称为粥样硬化斑形成，是早期AS的临床表现，其病理学特征是内膜内细胞外的脂质密集堆积，形成脂质核心。在其内膜边缘可看到巨噬细胞、平滑肌细胞和炎症细胞，同时在斑块的管腔表面可看到微血管、巨噬细胞、泡沫细胞和淋巴细胞[7]。V型，在脂质核心上形成纤维帽。脂质核心周围的毛细血管增生，同时伴有淋巴细胞、巨噬细胞和微出血存在。动脉狭窄就发生在这个阶段。VI型，斑块破裂，斑块内出血（IPH）和血栓沉积。炎症和血液动力学因素导致斑块破裂，进而导致溃疡和裂隙[8-9]，正常内皮细胞丢失，坏死的脂质核心的暴露。而斑块内新生血管的增生、破裂则会导致IPH，极有可能引起血栓形成。这些溃疡和裂隙可以在血栓周围重新出血和封闭，形成斑块内血肿和斑块内血栓[10]。当这个病变过程反复出现时，斑块迅速扩张，狭窄迅速发展，也增加了远端血栓栓塞事件的发生率。

2 小鼠AS模型的应用

Apo E-/-小鼠或LDLR-/-小鼠是研究AS最常用、最经典的两个动物模型。正常饮食条件下，Apo E-/-小鼠或LDLR-/-小鼠的血浆胆固醇水平较野生型小鼠的明显升高，且可自发产生AS。在高脂饮食诱导下，可加速AS病变的进程，长期诱导甚至出现斑块破裂，形成血栓。Apo E-/-或LDLR-/-小鼠发生AS的病变特点是以主动脉流出道最早出现，渐进发展到主动脉弓部及头臂干分支，严重的病变才会累及腹主动脉[11]。因此，主动脉流出道冷冻切片和主动脉油红染色分析是目前评价AS严重程度的公认标准。

3 小鼠AS模型成像技术的诊断评价

目前应用于小动物动脉粥样硬化斑块影像学评价方法主要有：CT、MRI、PET、超声成像等。随着生物工程技术的发展，越来越多的研究团队致力于纳米粒子的研究和多模态探针的设计，并结合生物医学实现疾病模型在分子水平上的成像。

3.1 CT

CT是非侵入性成像冠状动脉的最佳方式之一，小动物CT对活体小鼠的观察和测量可高达5um的像素分辨率。通过静脉内注射碘对比剂进行CT血管造影（CT angiography，CTA），可三维显示颅内血管系统。然而，它具有一定的放射性，并且当斑块严重钙化时，将影响图像的清晰度。利用X射线光谱的多色性可允许所谓的热点成像，即光谱CT[12]，可鉴别出不同的组织成分，包括组织携带的钙、碘、金等。Cormode及Peter[13-14]等人论证了将金纳米颗粒作为有效的细胞标记造影剂用于CT无创成像斑块内单核细胞的可行性。Meester等[15]人也通过动物实验论证了111In-DANBIRT是一种很有前景的分子成像探针，可用于评估进展性动脉粥样硬化。

3.2 MRI

MRI是一种强有力的动脉粥样硬化斑块形态学成像技术[16]。MRI不使用电离辐射，且在体内具有优越的空间分辨率[17]。此外，还可以应用对比剂来提高MRI检测的敏感性[18-19]。在小鼠AS模型中，小动物MRI扫描仪在电场强度为7T或更高时，其平面分辨率可达100um[20]。MRI使用多参数成像协议表征斑块组成，通过使用不同的脉冲序列使斑块各组成结构之间产生对比。多对比度MRI方案通常结合T1、T2及质子密度加权成像，对血管进行可视化，并可识别典型的斑块特征，包括血管壁厚度、斑块内出血、斑块钙化和纤维帽厚度[21]。但常规MRI扫描时间较长，不仅影响实验的操作时间和图像的即时性，还可能造成高的运动伪影率。MRI对比增强成像有助于区分斑块各组分，能选择性的与斑块受体结合的造影剂至关重要。常见的MRI分子探针包括用氧化铁或钆（Gd）标记的高密度脂蛋白纳米颗粒[22-24]以及与巨噬细胞清除受体相互作用的配体功能化的合成纳米颗粒[25]。有文献指出，CD44是斑块组织中过度表达的细胞表面蛋白，其水平与斑块破裂风险相关，并报道了透明质酸偶联氧化铁纳米粒子可靶向CD44成像[16]。然而，纳米颗粒的生产、成本和潜在毒性限制了它们的临床应用。葡聚糖被覆氧化铁具有良好的生物相容性，且对斑块巨噬细胞具有固有的亲和力[26]，是目前唯一一种被应用于临床的纳米颗粒制剂。

3.3 PET

PET成像是基于放射性标记示踪剂的使用，提供了一种高度敏感的方法来量化多种代谢事件，包括斑块组成、炎症、钙化等。然而，PET的空间分辨率低，需要与具有更好空间分辨率的装置所摄取的图像相重叠，如PET/CT和PET/MRI。

18F-FDG是最常见的示踪剂，与动脉粥样斑块中巨噬细胞的浸润高度相关，可用于检测斑块破坏的重要特征，包括新生血管形成[27]。18F-FDG已被广泛用于研究小鼠疾病模型中动脉粥样硬化的发生、进展和消退。其他放射性示踪剂包括2-（2-硝基-1h-咪唑-1-酰基）-n-（2,2,3,3,3-五氟丙基）乙酰胺[（18F）EF5] ，用于定量斑块密度的低氧标记物[28]。另外，Withana等人[29]证明了以半胱氨酸组织蛋白酶为靶点的活性探针（ABPs）可用于动脉粥样硬化小鼠模型，利用PET/CT对活化巨噬细胞群进行成像。

PET/CT是在CT扫描后进行PET采集，其显著局限性与非同步数据采集的非同步性有关[30-32]。CT扫描仅需要几秒钟，而PET成像则需较长时间，在两者进行图像采集的时间差中，往往由于器官运动和不同的呼吸周期造成重要的人为伪像[33]。此外，CT扫描的辐射风险以及对软组织的对比度降低是应用这种多模态成像技术的关键问题，与之相比，PET/MRI具有明显优势。目前，PET/CT仍广泛应用于临床和动物疾病模型的成像，动脉粥样硬化的PET/MRI成像还需要进一步研究，特别是，结合了功能磁共振成像技术[34]。

PET在动脉粥样硬化中的其他应用还包括通过使用18F-NaF定量斑块钙化[35]，以及使用11碳-醋酸酯合成脂肪酸[36]。

3.4 超声成像

超声医学是近半个世纪发展最为迅速的医学影像学分支，近年来也越来越多的应用于小动物疾病模型中病灶的成像，高频超声已被证明是监测和评估小动物疾病进展和药理作用的有效工具[37]。

小动物B超图像主要用于评估斑块的回声特性，通常是在病变动脉的纵切面获取图像，以便能最大程度显示斑块，彩色和功率多普勒能够进一步描绘出斑块边界。B型超声表征动脉粥样斑块的局限性主要是由于观察者间及观察者自身的一致性，以及较差的信噪比。采用实时合成技术，多角度重复扫描信息相结合，可提高图像的信噪比和观察者的一致性[38]。此外，应利用图像处理技术以便更好地评估斑块的回波性[39]。B超评价小动物动脉粥样硬化疾病的进展不仅可通过直观的对斑块成像，还可以通过关联脏器成像的改变来进行早期预测和评价。Wu J等人[40]的研究确定了高频超声诊断设备在评估高脂饮食诱发的肝脏疾病和早期动脉粥样硬化的啮齿动物模型中的结果的可靠性。

超声表征动脉粥样硬化斑块的最新进展是在超声造影（CEUS, contrast enhanced ultrasound）领域。CEUS技术使用静脉内注入微泡造影剂产生微泡作为血管示踪剂，以清楚地显示动脉斑块的轮廓并提高动脉斑块的检出率[41]。因微气泡只能在血管内流动，不会扩散到周围组织，故超声造影检查的所有信号都是血管内的，极少出现假性充盈缺损及外溢伪像，它可以弥补彩色多普勒超声的不足，更准确地反映血管内的血流状况。

超声造影可清楚地显示AS斑块中新生血管形成，通过使用特定脉冲序列抑制组织中的信号并增强微泡的信号，且从造影剂进入到完全消退的整个过程可以被完整记录下来，实时动态，使超声诊断的准确性明显提高。为了进一步提高超声测量的再现性，已经建立了定量方法，可使用定量分析软件量化动脉粥样硬化斑块超声造影后的时间-强度变化，获得斑块显影的峰值强度、达峰时间和增强强度等参数。为评估AS斑块的稳定性提供了一项简便，准确，无创的检查方法[42]。

近年来，文献报道了多种新型纳米探针靶向成像小动物AS模型的可行性[43-45]。这些靶向造影剂携带特异性抗体或配体，其能够通过抗原-抗体作用对斑块表面特异性成像，可提高诊断斑块新血管形成的准确性。Guo S等人[46]研究制备的靶向微泡可激活血小板上的糖蛋白IIb/IIIa受体，从而检测和定量AS模型小鼠晚期斑块表面活化的血小板。

随着对CEUS技术研究的深入，人们发现超声微泡造影剂不仅是一种良好的超声成像造影剂，而且是一种重要的药物输送载体。超声介导的靶向微泡给药（UTMD,ultrasound-targeted microbubble delivery）具有高安全性、高可控性和高效率的优点，具有广阔的应用前景。为了进一步增强微泡的靶向性，许多研究致力于设计新的微泡制备方案。Hong Y等人[47]提出用生物素化的ICAM1抗体（MBi）或生物素化的抗ICAM1抗体和血管生成抑制剂恩度星（endostar）偶联（MBie）制备靶向微泡并对Apo E基因敲除的AS模型小鼠进行UTMD治疗。

影像技术通过评估斑块的组成和定量炎性细胞及炎性过程，可无创监测动脉粥样硬化疾病的进展。在临床前研究中，已经实现了在动物模型体内通过纳米粒子结合不同的成像技术在单细胞水平上追踪动脉粥样硬化斑块中的免疫细胞活动[48]。此外，纳米技术为动脉粥样硬化靶向治疗的发展提供了创新工具。在未来的研究中，多种成像方式的结合以及新型纳米粒子的制备将会为动脉粥样硬化疾病的早期诊断及治疗提供新思路。