鼠源GFP-VNN1重组质粒的构建及其功能研究

李 琳，李 俊

重组人血管非炎性因子1基因(Vanin-1，VNN1)是一种位于细胞膜上的糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)-锚定蛋白，具有泛酰巯基乙胺酶活性，表达于人类及小鼠的多种组织中，其中肾脏、胸腺和脾等免疫组织具有较高的mRNA表达量[1]。多项研究[2-4]显示VNN1可以通过调控氧化应激反应标志物活性氧簇(ROS)、抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)、cysteamine及抗氧化蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)等分子或蛋白参与氧化应激反应，提示以VNN1基因为靶点的治疗未来有可能逆转氧化应激及炎症相关性疾病的进展。本实验拟通过体外构建能够稳定表达VNN1蛋白的重组质粒，并观察其转染RAW264.7细胞后对细胞因子分泌及细胞凋亡的影响，为深入探讨其参与免疫相关性疾病的分子机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞系及主要实验材料RAW264.7细胞系、绿色荧光蛋白(GFP)及DH5α感受态细胞由安徽省天然药物活性研究重点实验室保存。总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒(美国Thermo公司)；高糖DMEM液体培养基、胎牛血清(FBS)(美国Gibco公司)；凝胶纯化试剂盒、限制性内切酶、T4 DNA marker、DNA 连接酶(日本TaKaRa公司)；Lipofectamine 2000、Opti-MEM、TRIzol Reagent(美国Invitrogen公司)；流式试剂盒(上海贝博公司)；小鼠酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(上海酶联生物科技公司)；ECL显色试剂盒(美国Pierce公司)；BCA法蛋白浓度定量试剂盒(武汉生物科技有限公司)；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-6 (interleukin-6，IL-6)单克隆抗体(美国Abcam公司)；山羊抗兔IgG二抗、兔抗小鼠二抗(北京中杉金桥公司)。

1.2 实验仪器流式细胞仪、CO2恒温培养箱(美国Thermo公司)；细菌培养箱 (德国Heraeus公司)；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳仪、酶标仪(美国Bio-Red公司)；高速低温离心机(美国Sigma公司)；紫外凝胶成像系统(南京捷达生物技术公司)；PCR梯度扩增仪(德国Eppendoff公司)。

1.3 鼠源GFP-VNN1重组质粒构建从NCBI GenBank 数据库查找VNN1的DNA序列，根据引物设计原则用Primer 5.0软件设计PCR引物。上游引物:5′-AAGCTTCCGCTGCACCATGACTACTC-3′(下划线为HindⅢ酶切位点)，下游引物：5′-GGATCCGCTCGAGCTACCAACTTAATGA-3′(下划线为BamHⅠ酶切位点)。PCR反应条件为95 ℃、3 min；94 ℃、40 s；58 ℃、40 s；68 ℃、110 s；循环35次后72 ℃延伸10 min。PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳分离纯化。纯化后产物经双酶切法与GFP载体连接，连接产物转化摇菌，挑选阳性克隆，酶切法鉴定后，送至上海Invitrogen生物技术有限公司测序，序列比对正确后进行后续实验。

1.4 RAW264.7细胞培养RAW264.7细胞用含10% FBS的DMEM培养基置于37 ℃、5%CO2培养箱培养，培养基应加入青霉素和链霉素各100 U/ml。每天更换新鲜培养基，取处于对数期生长的细胞用于实验。

1.5 GFP-VNN1重组质粒转染RAW264.7细胞转染前24 h用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)消化细胞，接种2 ml密度为1.5×105/ml的待转染细胞于6孔板中，培养条件为37 ℃、5%CO2，待细胞贴壁生长后准备转染。分别将6 μl质粒和8 μl脂质体溶于150 μl OPTI-MEM培养基中，静置5 min后将两者混合均匀，室温静置15 min。弃去6孔板中旧DMEM培养基，PBS漂洗2次后加入1.7 ml OPTI-MEM，再逐滴加入质粒-脂质体混合物，混合均匀后置37 ℃、5%CO2培养6 h，然后更换含10% FBS 的DMEM完全培养基继续培养。

1.6 Western blot法检测细胞中VNN1、TNF-α和IL-6蛋白表达转染48 h后，裂解各组细胞得到总蛋白样品，加入2×SDS上样缓冲液于100 ℃煮沸5 min。BCA法测定蛋白浓度，与标准蛋白Marker一起进行8% SDS-PAGE凝胶电泳，用湿转法将蛋白转到PVDF膜上，TBST洗膜3次后，分别用VNN1、TNF-α、IL-6 的一抗于4 ℃过夜孵育。TBST洗膜后，加入VNN1、TNF-α、IL-6 的二抗室温孵育1 h，TBST洗膜后，ECL试剂盒显色，电脑显影成像，Image J 图像分析软件对各条带进行分析，实验重复3次。

1.7 ELISA法检测细胞上清液中TNF-α和IL-6表达转染48 h后，取出6孔板中各组细胞上清液，离心，按照ELISA试剂盒的操作步骤进行操作，加样、加酶、显色、终止等。使用酶标仪测量各孔吸光度，最后绘制标准曲线计算样本浓度。实验重复3次。

1.8 流式细胞术检测RAW264.7细胞凋亡情况转染48 h后，收集6孔板中各组细胞，按试剂盒说明书操作：每组用400 μl Binding Buffer重悬细胞，并加入5 μl Annexin V染液，避光孵育15 min，然后加入10 μl PI，避光孵育5 min，1 h内在流式仪上检测细胞凋亡情况。实验重复3次。

2 结果

2.1 GFP-VNN1重组质粒的构建及鉴定提取的GFP-VNN1质粒用HindⅢ和 BamHⅠ限制性内切酶双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳分离得到约1 542、4 735 bp两条带，与VNN1片段的大小和载体GFP的大小相符，表明VNN1已被插入到GFP 载体中。酶切结果见图1。VNN1基因测序结果与GenBank上的序列一致，表明GFP-VNN1表达载体构建正确，可用于后续实验。

图1 GFP-VNN1重组质粒经双酶切鉴定电泳图

M：DNA Marker；1：HindⅢ和BamHⅠ双酶切GFP-VNN1重组质粒

2.2 VNN1蛋白在RAW264.7细胞中的表达经Western blot法检测显示正常组、空质粒转染组以及GFP-VNN1重组质粒转染组细胞内均有VNN1蛋白表达。GFP-VNN1重组质粒转染组VNN1蛋白的表达明显高于其他两组细胞，与正常组比较差异有统计学意义(P<0.01,F=3.063)，见图2，表明GFP-VNN1重组质粒能在RAW264.7细胞稳定高表达VNN1蛋白。

图2 Western blot法检测RAW264.7细胞中VNN1蛋白的表达

N：正常组；NC：空质粒转染组；VNN1：GFP-VNN1重组质粒转染组；与正常组比较：**P<0.01

2.3 GFP-VNN1重组质粒对细胞因子TNF-α和IL-6分泌的影响ELISA结果显示，GFP-VNN1重组质粒能显著升高RAW264.7中TNF-α和IL-6的表达(P<0.05，F=0.082；P<0.05，F=0.592)，与正常组比较差异有统计学意义；Western blot法检测RAW264.7细胞中TNF-α和IL-6蛋白表达升高(P<0.05，F=1.538；P<0.05，F=1.509)，与正常组比较差异有统计学意义。结果见图3、4，提示GFP-VNN1重组质粒能促进细胞因子TNF-α和IL-6分泌。

2.4 GFP-VNN1重组质粒对RAW264.7细胞凋亡的影响与正常组比较，GFP-VNN1重组质粒转染组凋亡率升高，差异有统计学意义(P<0.05,F=0.076)。说明重组质粒GFP-VNN1能促进RAW264.7细胞发生凋亡。见图5。

3 讨论

泛酰巯基乙胺酶(Vanin,VNN)是近几年生物学研究的热点，是一种泛酰巯基乙胺的水解酶，能水解泛酰巯基乙胺形成泛酸和半胱胺。Vanin基因的亚型包括VNN1、VVN2和VNN3，小鼠体内有VNN1和VNN3两种亚型，位于10 号染色体的10A2B1; 人体内有VNN1、VVN2 和VNN3三种亚型，位于6号染色体的q22～24，人类和小鼠的Vanin 基因的总氨基酸具有高度一致性[5-7]。

图3 ELISA法检测GFP-VNN1重组质粒对 细胞因子TNF-α和IL-6分泌的影响

A：TNF-α；B：IL-6；N：正常组；NC：空质粒转染组；VNN1：GFP-VNN1重组质粒转染组；与正常组比较：*P<0.05

图4 Western blot法检测GFP-VNN1重组质粒对 细胞因子TNF-α和IL-6分泌的影响

N：正常组；NC：空质粒转染组；VNN1：GFP-VNN1重组质粒转染组；与正常组比较：*P<0.05

图5 流式细胞术检测GFP-VNN1重组质粒对RAW264.7细胞凋亡的影响

A： 3组流式细胞图比较; B: 3组细胞凋亡率比较；N：正常组；NC：空质粒转染组； VNN1：GFP-VNN1重组质粒转染组；与正常组比较：*P<0.05

VNN1是Vanin家族中研究最多的一个亚型，其对氧化应激反应的调控引起了越来越多科研人员的关注。研究[8]显示VNN1与NF-κB通路的激活成正相关，干扰VNN1基因后，不仅抑制了LPS对NF-κB的激活，还抑制了NF-κB的核转位，进而抑制了氧化应激和炎症的发生；同时应用NF-κB抑制剂BAY11-7082也能部分削弱VNN1介导的氧化应激反应。干扰VNN1表达的细胞株中即使给予白介素-1β(IL-1β)这一高效的促炎刺激因素，也未能引起炎症因子表达水平的增加，提示在炎症反应中VNN1是一个关键的作用因子[9]。研究[10]显示在小鼠糖尿病模型中，体内或体外实验中敲除VNN1基因后，胰岛细胞凋亡减弱，有学者推测VNN1基因可能通过调控组织释放cystamine对胰岛细胞产生保护作用。以上研究结果提示VNN1基因的表达与多项炎症相关性疾病的病程进展有很强的关联性。

在生物医学研究中GFP因其在相应波长的紫外光激发下发出绿色荧光故常作为标记蛋白，用以实时观察目标蛋白在细胞中的移动和定位，或用以检测基因转录效率，目的蛋白的表达量等[11-12]。GFP作为使用最为广泛的标记蛋白之一，由于其分子量小，可以与其他目的基因形成融合蛋白，且融合蛋白仍能保持荧光激发活性，同时不影响目的基因的生物活性[13]。

本实验通过基因重组技术成功建立了过表达VNN1的GFP-VNN1载体，并且进一步研究发现过表达VNN1能促进RAW264.7细胞炎性因子TNF-α、IL-6分泌和细胞的凋亡。本研究还发现与正常组比较，空质粒转染组VNN1、TNF-α、IL-6的表达均有轻微升高，这种现象可能是由于转染试剂中的Lipofectamine 2000所致。Lipofectamine 2000对细胞具有一定的毒性，可以激活RAW264.7细胞，分泌炎症因子如TNF-α和IL-6，导致空质粒转染组TNF-α和IL-6分泌增加。而TNF-α和IL-6为体内重要的炎症因子，能与相应的受体结合，激活相应的炎症反应，导致空质粒转染组VNN1的表达升高。本研究结果提示VNN1的高表达可能会加剧炎症相关性疾病的发展，而干扰VNN1表达则可能对疾病缓解有重要意义。本研究结果为深入研究VNN1基因的分子机制奠定了基础，并为研究其生物学活性和在免疫相关性疾病中的作用提供了新思路。以VNN1基因为靶点的治疗将可能逆转炎症等相关疾病的发展，但这需要通过大量的实验室研究和临床试验证实。