X染色体耦联锌指蛋白在胰腺癌组织中的表达及与患者预后的关系研究

秦学潜，翁 皖，郭晶晶，吴 钢

胰腺癌是一种恶性程度极高的肿瘤，约90%的胰腺癌为起源于胰腺上皮的导管腺癌，5年生存率不足5%，预后极差[1]。尽管在过去的20年间人们付出很大努力，其发病率和病死率近年来仍明显上升。预计到2030年，胰腺癌将成为全球第2位癌相关的死因[2]。胰腺癌的病因尚不十分清楚，其发生可能与吸烟、饮酒、高脂及高蛋白饮食等有关，又由于早期没有特殊症状易被忽视而导致没有被及时诊断。因此，从分子水平探究胰腺癌发生、发展机制，在胰腺癌的诊治与预后过程中寻找一种高特异性的诊断及预后指标，对提高胰腺癌患者生存率至关重要。X染色体耦联锌指蛋白(Zinc-finger protein X-linked，ZFX)是锌指蛋白家族的一员，在调控基因表达、细胞分化及胚胎发育等过程中扮演着重要角色[3]。最新研究[4]表明，ZFX不仅参与细胞的自我更新，而且可以促进恶性肿瘤的增殖、凋亡和迁移。但其与胰腺癌的相关性报道较少，这可能是由于对ZFX和胰腺癌之间的认知和研究依然在起步的阶段。为此，该研究采用免疫组化和Western blot检测ZFX蛋白在胰腺癌中的表达，发现其在生物学特性上对胰腺癌的影响，探讨其在胰腺癌发生、发展中的作用及临床意义，评价ZFX作为胰腺癌患者预后指标的临床价值。

1 材料与方法

1.1 病例资料60例配对的胰腺癌组织及癌旁无瘤组织均为上海市宝山区仁和医院普外科2008年1月～2012年12月手术切除标本，均经病理学证实。所有患者术前均未化疗或放疗，有完整的临床病理资料。男28例，女32例，年龄≥60岁的33例，<60岁的27例，平均年龄为70.6岁；按AJCC7胰腺癌TNM分期标准：0期2例，Ⅰ期8例，Ⅱ期18例，Ⅲ期20例，Ⅳ期12例；病理证实均为胰腺癌，按Edmondson’s标准[5]：高分化20例，中分化24例，低分化16例。所有标本的收集均经患者知情同意，并在手术切除后立即采集2份，1份置于灭活RNA酶的冻存管中液氮冷冻保存，另1份经10%甲醛固定后石蜡包埋。

1.2 主要试剂鼠抗人ZFX单克隆试剂抗体购自美国Abcam公司(稀释浓度1 ∶200)；鼠抗人β-actin单克隆抗体(稀释浓度1 ∶500)、全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司；山羊抗鼠IgG(稀释浓度1 ∶100)、通用型SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒和supersignal发光试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1免疫组化和结果判定 ZFX蛋白阳性信号定位于细胞核，因此以细胞核染色呈棕黄色为阳性，对染色的程度进行评分。细胞染色程度：阴性为0分，轻度为1分，中度为2分，重度为3分；在高倍镜下对切片进行观察并记录着色细胞的比例，着色细胞占记数细胞的百分率≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～100%为3分，将每张切片染色程度得分与染色细胞百分率得分各自相加为其最后得分:0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3分为阳性(++)，4～6分为强阳性(+++)。为统计方便，最终将++～+++定义为阳性，而其他定义为阴性[6]。

1.3.2Western blot分析 称取100 mg胰腺癌组织，按组织和细胞裂解液1 ∶10的比例加入全细胞裂解液，于冰上匀浆器充分匀浆后12 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液提取总蛋白，用酶标仪于592 nm波长行Bin-choninic Acid (BCA法)蛋白定量。煮沸(使蛋白变性)8 min后，按每孔60 μg蛋白量上样，以12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶80 V恒压跑至分离胶后，电压调至120 V直至分离胶底部，后经半干转膜法以1～1.5 mA/cm2恒流电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，PVDF膜置于一抗稀释液(1 ∶1 000稀释)中4 ℃过夜，PBST及PBS洗膜10 min×3次，再置于二抗稀释液(1 ∶1 000稀释)中室温孵育2 h，PBST及PBS洗膜10 min×3次，加入化学发光底物(super signal west)，显影，β-actin作为内参照，用Quantity One 4.3.1凝胶图象分析系统扫描ZFX蛋白灰度值，取不同泳道蛋白的灰度值与相应内参β-actin的比值代表各蛋白的相对表达水平，进行统计学分析。

2 结果

2.1 免疫组化检测ZFX蛋白在胰腺癌组织及癌旁组织中的表达情况ZFX蛋白的表达位于组织细胞的细胞核。胰腺癌组织中ZFX蛋白的阳性反应呈染色均一的棕黄色或棕褐色颗粒，阳性率为63.3%(38/60)；而癌旁组织也可见ZFX蛋白的阳性表达，但反应颜色较浅，呈浅黄色，阳性率为36.7%(22/60)，明显低于相应癌组织(P<0.001)，图1A-C。

2.2 Western blot方法检测ZFX蛋白在胰腺癌及癌旁组织中的表达情况ZFX蛋白在胰腺癌组和癌旁组中的相对表达量分别为(0.61±0.05)和(0.25±0.08)，两组之间蛋白的相对表达量差异有统计学意义(F=8.311，P<0.05)。见图2。

图1 ZFX蛋白在胰腺癌组织及癌旁组织中的表达

A：癌旁组织中ZFX蛋白阴性表达；B：胰腺癌组织中ZFX蛋白阳性表达(+++)；C：胰腺癌及癌旁组织中ZFX蛋白表达强度评分；与胰腺癌组织比较：***P<0.001

图2 Western blot法检测ZFX蛋白在部分胰腺癌及癌旁组织中的表达

T：胰腺癌组织；A：癌旁组织；1～4：任意选取4对胰腺癌组织及癌旁组织

2.3 ZFX蛋白表达与胰腺癌临床病理参数的关系胰腺癌组织中ZFX蛋白的表达水平与胰腺癌患者的年龄、性别、分化程度和肿瘤大小、部位等临床病理指标均不相关(P>0.05)，而与肿瘤的TNM分期和淋巴转移有关(P<0.01)，见表1。

2.4 胰腺癌ZFX表达与预后的关系60例获得随访患者中，ZFX蛋白阴性的胰腺癌患者的总生存中位时间为16.5个月(95%CI：10.83～22.17)，ZFX阳性表达患者总生存中位时间为7.0个月(95%CI：5.87～8.13)，两者比较，差异有统计学意义(Log-rank值=17.784，P<0.001)。见图3。

表1 ZFX蛋白表达与胰腺癌临床病理参数的关系

图3 ZFX阳性表达与阴性表达胰腺癌患者的生存曲线

3 讨论

ZFX是锌指蛋白家族的一员，其含有13个C2H2的锌指结构。ZFX基因位于哺乳动物的X染色体上，其表达在哺乳动物中呈高度保守性，其结构包含一个酸性转录激活区、一个核定位序列及一个DNA结合位点。由于其自身的结构特点，锌指蛋白可以选择性地结合特异的靶结构，在基因的表达调控、细胞分化、胚胎发育等生命过程中发挥重要作用[7]。ZFX在多种干细胞的自我更新和抗凋亡机制中起着重要作用[8]。近来研究[9-11]发现ZFX在前列腺癌、脑癌、脑胶质细胞瘤、喉癌、胃癌、淋巴瘤等多种人类恶性肿瘤中过表达，在致癌转化中起重要作用。如在非小细胞肺癌中，ZFX可以通过调节MMP2的表达促进肺癌细胞的侵袭转移，而此过程需要PI3K/Akt和STAT3的参与[11]。在胆囊癌中，miR-101通过直接作用于ZFX的启动子，抑制ZFX的表达，从而阻断TGF-β/Smad诱导的上皮间质转化[9]。

本研究免疫组化和Western blot结果均显示胰腺癌组织中存在ZFX蛋白的异常高表达，即ZFX蛋白在胰腺癌组织中的表达率(63.3%)显著高于癌旁组织(36.7%)，其在胰腺癌组织中的表达量(0.61±0.05)也显著高于癌旁组织(0.25±0.08)，提示ZFX可能在胰腺癌的发生过程中发挥作用。在与胰腺癌临床病理相关性研究发现ZFX蛋白的过表达与胰腺癌的TNM分期及淋巴转移密切相关，TMN分期中Ⅱ～Ⅳ期的ZFX阳性率明显高于0～Ⅰ期，提示ZFX的表达与胰腺癌的发生发展密切相关，即ZFX可能参与了胰腺癌的恶性进展过程。

另有研究[4]发现ZFX可促进胆囊癌细胞的增殖和侵袭转移，临床资料显示ZFX是胆囊癌独立预后因素。ZFX作为miR-144下游一个重要效应分子参与胃癌的骨转移，并且体外实验提示上调miR-144还可以抑制ZFX来促进胃癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性[12]。细胞功能实验表明，ZFX可以通过调控ERK-MAPK信号通路促进胃癌细胞株SGC7901和MGC803的增殖和抑制其凋亡[12-13]。Lai et al[14]发现在肝细胞肝癌组织中，ZFX蛋白和信使RNA的水平显著高于癌旁非肿瘤组织。ZFX siRNA抑制人肝癌细胞的增殖，诱导细胞周期发生G0/G1期阻滞，促进细胞的凋亡。这些研究体现了ZFX在恶性肿瘤中的重要功能。在胰腺癌研究领域，该分子与胰腺癌临床病理特征及预后的关系鲜有报道[15]。本研究中Kaplan-Meier生存曲线分析结果提示ZFX表达阳性的患者的总体生存率明显低于阴性患者，提示ZFX是胰腺癌预后影响因素，因此一定程度上可以作为胰腺癌预后的预测指标。

综上所述，研究中ZFX蛋白在胰腺癌中高表达，与胰腺癌侵袭转移密切相关。胰腺癌组织中ZFX表达阴性者预后优于表达阳性者，或许可作为胰腺癌预后独立预测指标，有助于对预后作出指导和预后情况的及时了解。然而对于ZFX作用、分子机制仍需进一步研究，以期为探讨胰腺癌发病的分子机制提供帮助，也为胰腺癌的靶向治疗提供新的思路。