仙鹤草提取物对饲料中亚硝酸盐的清除作用

苏学军， 刘广聪， 宗春燕

（泰州职业技术学院药学院，江苏泰州225300）

亚硝酸盐是威胁动物健康的一种有毒物质。过量的亚硝酸盐进入血液中， 会导致动物全身组织缺氧， 造成呼吸困难及神经机能紊乱（余文兰等，2017），严重时可致动物死亡。通常饲料中的亚硝酸盐含量极少， 但若调制不当或因贮藏条件不适，产品受到污染（王春林，2000），在还原酶及有害菌的作用下， 残留在饲料中的硝酸盐会大量地转化成亚硝酸盐，从而使含量超标。饲料中的亚硝酸盐一方面能引起动物的急、慢性损害，影响动物的生产性能和繁殖能力； 另一方面其作为一种氧化剂， 会氧化饲料中的还原性营养成分（齐德生等，2003），降低饲料的营养价值。在动物的胃肠道内，亚硝酸盐易与仲胺类物质发生亚硝化反应，生成致癌性强的亚硝胺（Yang 等，2009），从而增加动物消化器官癌变的风险， 这对人类健康也构成了潜在威胁。 因此，研究清除饲料中的亚硝酸盐，降低饲料中亚硝酸盐的残留量， 对于人类与动物的安全具有积极意义。

仙鹤草（Agrimonia pilosaLedeb.）系蔷薇科多年生草本植物，又名龙牙草、脱力草、石打穿等（路芳等，2012）， 广泛分布于我国南北各地。 研究表明，仙鹤草提取物可用于防治家畜流行性腹泻、绦虫病，可以治疗牛血乳病，对猪链球菌也有明显的抑制作用（陈应战，2015；吴周水，1998）。 目前，对仙鹤草的研究多集中在药理活性及临床应用方面， 而关于其清除饲料中亚硝酸盐的研究鲜有报道。 本试验通过超声波辅助提取工艺制备仙鹤草提取物， 研究其在体外模拟胃液条件下对饲料中亚硝酸盐的清除作用， 以期为仙鹤草资源的开发利用提供一种新途径。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 原料与试剂 饲料购自本地饲料市场，四分法浓缩至200 g，粉碎后过筛，混匀，密封低温保存；仙鹤草购自同仁堂大药房；无水乙醇、亚硝酸钠、硫酸锌、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺，均为市售分析纯试剂。

模拟胃液（梅胜等，2017）：称取2.0 g NaCl 及3.2 g 猪胃蛋白酶， 双蒸水溶解后加入7 mL 浓盐酸，定容于1 L 容量瓶内。

1.1.2 主要仪器与设备 Cary 60 紫外-可见分光光度计；HH-S1 数显恒温水浴锅；BJ-150 多功能粉碎机；LRH-250F 生化培养箱；KQ5200E 超声波清洗器；RE-52AA 旋转蒸发器。

1.2 试验方法

1.2.1 仙鹤草提取物的制备 仙鹤草去杂后，置于减压干燥箱内烘干至脆，粉碎，过40 目筛。准确称取5 g 粉末，加入100 mL 质量分数为60%的乙醇浸泡30 min，50 ℃下超声辅助提取20 min。 过滤，滤渣中加入上述乙醇80 mL 于相同条件下再超声提取1 次， 合并滤液，70 ℃下旋转蒸发至浸膏状， 以60%的乙醇溶解后定容于100 mL 棕色容量瓶中， 即得质量浓度50 mg/mL 的仙鹤草提取物原液。 将原液配成不同质量浓度的稀释液，避光冷藏备用。

1.2.2 亚硝酸盐标准曲线的绘制 采用盐酸萘乙二胺比色法（钟希琼等，2015），建立亚硝酸盐标准曲线。

1.2.3 亚硝酸盐清除率的测定 分别移取不同质量浓度的仙鹤草提取物1 mL，置于25 mL 的比色管内， 各加入8 mL 模拟胃液， 再加入20 μg/mL NaNO2标准溶液1 mL，37 ℃水浴， 反应至既定时间后，加入2 mL 0.4%对氨基苯磺酸溶液，摇匀，5 min后立刻加入1 mL 0.2% 盐酸萘乙二胺溶液，摇匀，蒸馏水定容，静置15 min，在波长538 nm 处测定吸光度。平行测定3 次，按下式计算仙鹤草提取物对亚硝酸盐的清除率。

式中：A0为未加入提取物时的吸光度；Ai为加入提取物后的吸光度；Aj为提取物本底吸光度。

1.2.4 仙鹤草提取物对饲料中亚硝酸盐的清除作用 称取10 g 粉碎混匀的饲料样品两份，分别置于150 mL 锥形瓶中， 其中一份加入模拟胃液8 mL 及仙鹤草提取液50 mL， 放置在37 ℃的恒温水浴振荡器中，220 r/min 孵育1 h （王瑞国等，2015）。取出，过滤、洗涤、烘干得滤渣。将滤渣及另一份样品各自加入蒸馏水100 mL 和20% NaOH溶液1.2 mL，调节pH 至8 ～9，全部转至200 mL棕色容量瓶内。加入0.42 mol/L 的硫酸锌溶液10 mL，摇匀，直至蛋白质完全沉淀。 然后于60 ℃水浴中加热15 min，室温冷却后，蒸馏水定容，静置30 min（少量油脂可用吸管吸去）。过滤，弃去初滤液20 mL，剩余滤液作为样品试液备用。 取25 mL比色管，加入10 mL 样品试液，按1.2.3 加入显色剂进行显色， 并根据回归方程计算出样品中亚硝酸盐的含量，按下式计算清除率。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制 以亚硝酸钠质量m（μg)为横坐标，538 nm 处吸光度A 值为纵坐标，作m-A 函数图， 见图1， 得相应的回归方程为A=0.0301m+0.0012，R2=0.9997，线性检测范围为0 ～12.5 μg。

图1 亚硝酸盐标准曲线

2.2 不同质量浓度仙鹤草提取物对亚硝酸盐的清除作用 分别移取质量浓度为2、4、6、8、10、12 mg/mL 的仙鹤草提取物1 mL 与亚硝酸盐反应20 min，其清除效果见图2。

图2 不同质量浓度仙鹤草提取物对亚硝酸盐的清除作用

由图2 可见， 仙鹤草提取物对亚硝酸盐的清除能力表现为提取物浓度增大后清除率迅速升高，当浓度为10 mg/mL 时，再增大提取物浓度，清除率不再有显著变化（P ＞0.05）。两者之间符合良好对数曲线关系， 经拟合得y=30.145ln （x)+24.251，R2=0.9929。仙鹤草提取物对亚硝酸盐的半数清除率浓度IC50为2.349 mg/mL，表明提取物对亚硝酸盐的清除能力较强。

2.3 不同反应时间仙鹤草提取物对亚硝酸盐的清除作用 取质量浓度为10 mg/mL 的仙鹤草提取物1 mL 分别与亚硝酸盐反应5、10、15、20、25、30 min，其清除效果见图3。

图3 不同反应时间仙鹤草提取物对亚硝酸盐的清除作用

由图3 可见， 仙鹤草提取物对亚硝酸盐的清除率随反应时间的延长而快速上升， 反应30 min，清除率为95.37%。清除率与反应时间也符合良好对数曲线关系， 经拟合得y=16.434ln （x）+41.985，R2=0.9762。 达到半数清除率时，清除所需时间IT50为1.629 min，说明仙鹤草提取物对亚硝酸盐的清除反应速率较快， 能在较短的时间内达到平衡。

2.4 仙鹤草提取物对不同种类饲料中亚硝酸盐的清除效果 由表1 可知， 供试的4 种饲料中亚硝酸盐含量均较低，最高值为1.25 mg/kg，远低于GB13078-2017 饲料卫生标准中的亚硝酸盐允许量。 仙鹤草提取物对4 种饲料中的亚硝酸盐均具有清除作用，并表现出一定的差异性，其中对小猪配合饲料的平均清除率为43.34%，而对鸡浓缩饲料的平均清除率仅为27.43%。仙鹤草提取物直接与亚硝酸盐作用时清除效果较好， 但与饲料中的亚硝酸盐作用时， 清除能力则表现出一定程度的下降， 这可能是由于在模拟胃液消化过程中饲料中亚硝酸盐未能全部溶出， 提取物无法与其完全反应，造成清除率降低。 尽管如此，仙鹤草提取物对供试饲料中的亚硝酸盐仍具有一定的清除作用，清除率均在27%以上。

表1 仙鹤草提取物对饲料中亚硝酸盐的清除作用

3 讨论

仙鹤草是一种常见的中草药， 近年来在饲料工业和畜牧生产中得到了广泛应用。 青草期的仙鹤草营养价值丰富，富含蛋白质、糖类及各种矿物元素，可用作动物饲料。 研究表明，仙鹤草具有消炎止血、补虚止痢、降血糖、抗氧化、抗肿瘤等功效（徐威等，2016；周晓蓉等，2011；He 等，2010）。 在鸡饲料中添加仙鹤草， 可以起到预防和治疗鸡绦虫的作用， 并能改善鸡的生产性能 （彭晓英，2002）。 吴周水（1998）用仙鹤草组方预防耕牛中暑、治疗猪外伤出血，疗效显著。 仙鹤草具有广谱抗流感病毒活性， 可有效控制禽流感 （吕玲，2010）。 本研究结果表明，仙鹤草还具有清除饲料中亚硝酸盐的能力，能提高饲料制品的安全性能。

仙鹤草中含有黄酮类、三萜类、鞣质类、酚类、多糖类等多种抗氧化活性成分（路芳等，2012），亚硝酸盐在动物体内表现为一种氧化剂， 抗氧化成分可通过氧化还原反应实现对亚硝酸盐的清除。由于本试验所得的仙鹤草提取物为粗品， 在清除亚硝酸盐时发挥主要作用的成分尚不能明确，有可能是多种成分的协同作用， 因此需进一步对粗提取物中天然单体化合物进行分离纯化， 确定活性成分与清除亚硝酸盐之间的构效关系。

4 结论

在体外模拟胃液条件下， 仙鹤草提取物对亚硝酸盐具有较强的清除能力， 清除效果与提取物浓度及反应时间有关， 在试验范围内符合良好对数曲线关系。清除试验表明，仙鹤草提取物对4 种饲料中的亚硝酸盐均具有一定程度的清除作用，说明仙鹤草提取物对于动物健康具有潜在保健功能。