氨化秸秆与苜蓿组合对其营养成分及瘤胃微生物区系的影响

于满满， 张美美， 孙悠然， 谢小来

（东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨150030）

反刍动物瘤胃内存在着大量、 复杂的微生物菌群，其中非致病性微生物主要包括瘤胃细菌、厌氧真菌和瘤胃原虫（严淑红，2016）。这3 种微生物之间相互协同与竞争， 是瘤胃微生态保持动态平衡的重要因素，是促进反刍动物生长发育，维持机体健康的前提。 瘤胃微生物的生长发育受动物年龄、品种、地域环境、季节和饲料种类等不同因素影响（李岚捷，2017），而粗饲料则是影响瘤胃微生物区系的最直接因素， 不同粗饲料种类及其组合对瘤胃微生物菌群的影响各不相同， 研究粗饲料组合对瘤胃微生物区系的影响意义重大。

苜蓿是反刍动物饲养中重要的粗饲料， 营养价值很高，蛋白质含量约为20%以上，粗纤维约为25%，且可消化粗纤维比例较高，氨基酸组合平衡，维生素含量丰富，但其价格也相对较高，饲养成本提高（Blümmel 等，2010）。 许多研究表明，氨化时秸秆中有机物与氨发生氨解作用， 破坏了木质素与纤维素之间的酯键， 形成铵盐为瘤胃微生物提供氮源，从而提高了瘤胃微生物活力，改善了秸秆营养价值（Saenger 等，1982），在国内外均有广泛的应用。 氨化处理后的秸秆其粗蛋白质含量、采食量（Fernando 等，2010；Herrerasaldana 等，1983）以及有机物、酸性洗涤纤维和干物质消化率均有所提高（Herrerasaldana 等，1983），从而提高反刍动物的生产性能。因此，本研究将苜蓿干草和氨化玉米秸秆以不同比例混合， 旨在探究两种粗饲料原料的最优组合， 为今后优化反刍动物饲料组合， 降低畜牧业饲养成本和提高饲料利用率提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及前处理 苜蓿（AM）采自黑龙江省哈尔滨市双城区雀巢DFI 奶牛场；氨化玉米秸秆（ACS）由黑龙江省哈尔滨市东北农业大学动物科学技术学院提供。 其中，氨化玉米秸秆由高压氨化系统制备，即将新鲜玉米秸秆晾晒至其含水量为10%左右后，置于高压氨化设备中，充入氨气，在0.3 Mpa 压力条件下，氨化3 h 制得氨化玉米秸秆试验样品。 饲料样品经65 ℃干燥制成风干样，经1 mm 筛粉碎后过40 目筛，密封保存以备用。

1.2 试验设计 采用单因子试验设计，AM 和ACS 以100∶0、80∶20、60∶40、50∶50、40∶60、20∶80 和0∶100 比例进行组合，每种组合3 个重复，同时设置3 个空白样品（发酵管中不加发酵底物）。

1.3 体外发酵培养试验 试验选择3 头健康状况良好、年龄相近、体重（550±50）kg、装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛（干奶期），并于东北农业大学阿城实验基地进行瘤胃液的采集工作。 试验牛精料（每头4 kg/d）被等分为2 份，分别在7:00 和17:00 饲喂，粗饲料为干羊草，自由采食和饮水。 瘤胃液供体牛精料组成及营养水平见表1。

表1 精料组成及营养水平（干物质基础）

1.4 瘤胃DNA 的提取 参考天根TIANamp Stool DNA Kit 粪便基因组DNA 提取试剂盒（离心柱型，目录号： DP328）说明书，提取瘤胃微生物总DNA。 利用紫外分光光度计对OD260/OD280纯度及DNA 的浓度进行检测， 并用Marker 为DL2000，0.8%和1%琼脂糖凝胶电泳分别检测瘤胃微生物总DNA 和瘤胃微生物DNA 的完整性，利用凝胶成像分析系统在电泳结束后进行摄像。

1.5 体外发酵培养试验 试验根据Menke 等（1988）及Schofield 等（1995）方法进行。 准确称取200 mg 饲料组合样品（DM 基础）装入2.0 cm×3.0 cm 的尼龙袋（50 μm）后，置于发酵管（100 mL 玻璃注射器）底部。 试验当日，于晨饲前2 h 采集3头牛不同位点的瘤胃液， 经4 层纱布过滤后放入预热并充满CO2的保温瓶，密封后迅速带回实验室。将人工瘤胃缓冲液和瘤胃液按比例混合（瘤胃液体积∶缓冲液体积=1∶2，39 ℃水浴保温），其中缓冲液参照Menke 等（1988）配制方法。 每个发酵管准确抽取30 mL 人工瘤胃液，操作过程持续通入CO2直至接种完毕。 将接种好的发酵管中排出全部气体后， 立即用止流夹封住发酵管针头部分的橡胶管，密封后置于39 ℃的恒温水浴摇床中培养48 h 后终止发酵。

1.6 测定指标及方法

1.6.1 粗饲料常规成分 干物质（DM）、粗蛋白质（CP）、粗脂肪（EE）和粗灰分（Ash）的测定分析过程参照国标相关规定操作。中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）利用ANKON 半自动纤维测量仪进行测定。 不同比例氨化秸秆替代苜蓿的营养成分含量计算公式如下：

AB 饲草组合营养成分含量=A 饲草比例×A饲草营养成分含量+B 饲草比例×B 饲草营养成分含量；

瘤胃微生物相对数量表示为相对于瘤胃总细菌16S rDNA 的百分比，公式如下：

目标菌相对数量/%=2-（Ct目标菌-Ct 总细菌）×100；

式中：Ct 目标菌为目标菌引物所测的Ct 值，Ct 总细菌为以总细菌为引物所得的Ct 值。

1.6.2 瘤胃微生物 试验测定的瘤胃微生物包括产琥珀酸丝状杆菌、黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球、真菌、溶纤维丁酸弧菌和原虫。 在发酵试验后3、6、12、24、48 h 时，取一部分发酵培养液快速置于液氮罐中并转移到-80 ℃冰箱中保存， 用于瘤胃微生物DNA 的提取。

1.7 数据处理与分析 试验数据采用Excel 2016 进行简单处理和分析后， 再利用SPSS 19.0软件中的单因子方差分析 （one-way ANOVA，LSD），并进行Duncan 氏多重比较检验。 结果采用“平均值±标准差”表示，P ＜0.05 为差异显著。

2 结果

2.1 氨化秸秆与苜蓿组合对其营养成分的影响表2 为7 组不同比例氨化秸秆和苜蓿组合的营养成分。结果表明，不同比例氨化秸秆和苜蓿组合的各组DM 含量相差较小，AM:ACS （100:0） 组与AM:ACS（0:100）组DM 含量仅相差1.2%；CP、EE和Ash 的含量随氨化秸秆添加比例的提高而不断降低；ADF 和NDF 的含量随着氨化秸秆添加比例的提高而不断增加。

表2 氨化秸秆与苜蓿不同比例组合的营养成分（干物质基础） %

2.2 瘤胃微生物DNA 的Real-time PCR 定量结果 由各菌群相对数量的变化趋势图（如图1～图6） 可知， 不同比例氨化秸秆和苜蓿组合对体外发酵48 h 后几种瘤胃微生物产生不同程度的影响。 从整体变化趋势上看，在发酵48 h 后，与发酵3 h 时各菌群的相对数量相比，黄色瘤胃球菌和原虫的相对数量显著降低 （P ＜0.05），而产琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌和真菌的相对数量则显著上升（P ＜0.05），溶纤维丁酸弧菌的相对数量无明显变化。 由表3 可知，在发酵48 h时，原虫的相对数量在所测定的瘤胃微生物中数量最多，而真菌的相对数量最少；在三种主要的纤维分解菌中，白色瘤胃球菌的相对数量明显高于黄色瘤胃球菌，产琥珀酸丝状杆菌的相对数量显著高于（P ＜0.05）其他两种纤维分解菌，且随着氨化秸秆添加比例的提高整体呈上升趋势，其中AM:ACS（20:80）组的黄色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌的相对数量达到最高值， 分别为0.036%和0.26%。

表3 氨化秸秆与苜蓿不同比例组合对体外发酵48 h 时瘤胃微生物区系的影响16S rDNA%

图1 氨化秸秆与苜蓿不同比例组合对体外瘤胃发酵液黄色瘤胃球菌相对数量的变化趋势图

图2 氨化秸秆与苜蓿不同比例组合对体外瘤胃发酵液白色瘤胃球菌相对数量的变化趋势图

图3 氨化秸秆与苜蓿不同比例组合对体外瘤胃发酵液产琥珀酸丝状杆菌相对数量的变化趋势图

图4 氨化秸秆与苜蓿不同比例组合对体外瘤胃发酵液溶纤维丁酸弧菌相对数量的变化趋势图

图5 氨化秸秆与苜蓿不同比例组合对体外瘤胃发酵液原虫相对数量的变化趋势图

图6 氨化秸秆与苜蓿不同比例组合对体外瘤胃发酵液真菌相对数量的变化趋势图

3 讨论

3.1 氨化秸秆与苜蓿组合对营养成分的影响CP 含量是评价饲料营养价值的重要指标之一。在本试验中， 各组CP 含量随着组合中添加氨化秸秆比例的增加呈逐渐降低的趋势， 其中添加100%苜蓿干草的CP 含量最高而添加100%氨化玉米秸秆的CP 含量则最低，且两者相差5.81%。而两者DM 含量接近。这可能是由于苜蓿干草和玉米秸秆分别属于豆科植物和禾本科植物，而豆科植物的CP 含量及可溶性糖一般要高于禾本科植物，而苜蓿干草为优质豆科牧草，营养品质优于其他粗饲料， 并且其本身CP 含量相对较高（王芳等，2016）。 因此添加100%苜蓿干草的CP含量明显高于其余各组。

陈晓琳 （2014） 研究认为， 饲料中NDF 和ADF 含量与CP 含量呈负相关，即随着饲料中CP含量的不断增加，NDF 和ADF 含量会随之不断降低。在本试验中，NDF 和ADF 的含量随着氨化秸秆添加比例的提高而不断增加， 而CP 含量则随着氨化秸秆添加比例的不断提高而逐渐呈下降趋势， 说明饲料中CP 含量与NDF、NDF 含量呈负相关关系。 试验发现，氨化玉米秸秆的NDF和ADF 含量最高， 分别为70.41%和54.43%，均明显高于苜蓿干草。说明氨化玉米秸秆的纤维类物质含量较高，在瘤胃中不易被瘤胃微生物消化分解， 而苜蓿干草的NDF 和ADF 含量最低，分别为45.56%和35.32%，说明容易在瘤胃中被微生物降解利用。 本试验中苜蓿干草的NDF 和ADF 含量与马键等（2016）试验结果相似，但CP含量较低，这可能是由于饲料来源不同而导致结果的差异。因此，苜蓿干草其营养价值相对较高，优于氨化玉米秸秆。

3.2 氨化秸秆与苜蓿组合对瘤胃微生物区系的影响 反刍动物体内独有的种类繁杂、数量庞大却又相互竞争和协同的瘤胃微生物群落，其中细菌（数量为109～1010cfu/mL）、真菌（数量为103～105cfu/mL）和原虫（数量为105～106cfu/mL）（Hungate 等，1969）参与饲料发酵降解，它们通过一系列的生物化学反应将饲料的营养物质消化转化成VFA 和MCP， 为反刍动物提供物质能源（Wallace 等，1997）， 维持瘤胃功能健康稳定，保障反刍动物生产性能，科学合理地利用和开发饲料资源具有举足轻重的意义。维持瘤胃微生物区系动态平衡是保证瘤胃健康发育和维系机体正常的重要前提。

瘤胃细菌是目前研究最多的一类， 它们主要降解纤维素、果胶、淀粉、蛋白质和糖类等物质，对宿主机体健康和生产性能起主导作用（Welkie等，2010）。其中主要附着在植物碎片上的纤维分解菌对降解饲料具有重要作用， 在高粗料日粮下，主要包括黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌和溶纤维丁酸弧菌。瘤胃菌群多样性受日粮组成影响，不同品质的日粮条件下其菌种数量也发生改变（Chaucheyras-Durand 等，2012）。在本试验中，产琥珀酸丝状杆菌的相对数量显著高于其他两种纤维分解菌，并随着发酵时间的延长和氨化秸秆的添加比例的提高，整体呈上升趋势。其原因在于瘤胃内产琥珀酸丝状杆菌分布广泛，是瘤胃纤维降解优势菌种之一，降解结构坚韧物质（如秸秆）的能力很强，特别是在以粗饲料为主的日粮条件下， 氨化秸秆的NDF 和ADF 含量高于苜蓿干草，促进了产琥珀酸丝状杆菌的繁殖，使其优势高于其他分解菌种（Fernando 等，2010）。 由各菌群变化趋势图可以发现，黄色瘤胃球菌的数量随发酵时间的延长而呈不断下降的趋势，在发酵48 h 后，白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌的数量明显高于发酵初期，尤其是AM:ACS（20:80）组的黄色瘤胃球菌的相对数量（0.036%）显著高于其余各组。以上结果表明在添加20%苜蓿干草和80%氨化秸秆进行体外产气发酵时，产琥珀酸丝状杆菌和白色瘤胃球菌为优势菌群。 研究发现，白色瘤胃球菌的亲和力高于黄色瘤胃球菌，对纤维的附着能力远胜于黄色瘤胃球菌，由于两种菌在吸附过程中具有相同的屏障和附着点，白色瘤胃球菌能抢占黄色瘤胃球菌的附着点，存在竞争关系，而与产琥珀酸丝状杆菌的附着位点不一致， 几乎不存在竞争关系（周瑞等，2016）。 此外，也有研究表明，在体外培养这三种瘤胃纤维分解菌优势菌时，发现在生长过程中白色瘤胃球菌会生成一种未知的抑制因子，对黄色瘤胃球菌生长有竞争排斥作用，从而抑制其数量的增长（Chen 等，2001）。 以上试验结果与孙攀峰（2007）在研究苜蓿与稻草不同比例组合时，主要纤维分解菌的变化趋势一致。 溶纤维丁酸弧菌为蛋白降解菌，还可以有效利用木聚糖，分解果胶等。本试验研究发现，不同比例氨化秸秆代替苜蓿干草的组合对溶纤维丁酸弧菌的数量无明显影响，说明苜蓿干草与氨化秸秆组合后的CP 含量， 适宜溶纤维丁酸弧菌的生长繁殖，有利于维持其数量稳定。

真菌和原虫对瘤胃内纤维素也有一定的降解作用。瘤胃真菌降解纤维素的能力和穿透能力强，可以穿透粗饲料的角质层屏障，使植物纤维组织变得松软从而易于被瘤胃微生物定植，加速纤维素物质的降解，甚至是一些木质素（祁茹等，2011）。本试验研究发现，瘤胃真菌的相对数量显著低于其他纤维降解菌，说明瘤胃细菌与真菌存在拮抗作用（Dehority 等，2000）。 也有研究表明，黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌对瘤胃真菌降解纤维物质的能力具有抑制作用 （Roger 等，1992；Bernalier 等，1992）。 与试验发酵初期相比，发酵结束时瘤胃真菌的相对数量增加，导致其现象的原因可能是真菌在瘤胃微生物中的占比较低，对纤维降解的贡献率要小于瘤胃细菌 （Akin 等，1962），同时其更偏向于利用粗日粮中的木质素而非纤维素类的物质（Tuyen 等，2012）。 原虫是通过物理作用破坏植物组织， 并分泌一系列降解纤维素的酶类（纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶等），促进植物细胞壁的消化利用。在本试验中，原虫在微生物区系中的相对数量最高，发酵48 h 后，其相对数量明显低于发酵初期， 这表明原虫有选择性的捕食吞噬瘤胃细菌。 本试验中黄色瘤胃球菌的相对数量变化趋势与原虫的相对数量变化趋势一致， 可推测在苜蓿干草与氨化秸秆组合的日粮条件下，原虫主要捕食黄色瘤胃球菌，使细菌与原虫数量整体处于动态平衡（Williams 等，1992）。

4 结论

20%的苜蓿干草和80%的氨化秸秆组合可有效提高其营养成分的互补,增强瘤胃内主要纤维分解菌的活性，有助于真菌的定植，促进瘤胃微生物的发酵。