不同部位牦牛肉肌纤维特性与肉品质差异

杨玉莹，张一敏，毛衍伟，梁荣蓉，董鹏程，杨啸吟，朱立贤,*，罗 欣,2,*，张文华，曹 晖

（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271018；2.江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，江苏 南京 210095；3.国家肉牛牦牛产业技术体系中卫试验站，宁夏 中卫 755000；4.国家肉牛牦牛产业技术体系宝鸡试验站，陕西 宝鸡 721000）

我国牦牛资源丰富，主要分布于青海、甘肃、西藏、四川、新疆和云南省，占世界牦牛总量的95%[1]。牦牛肉富含蛋白质，脂肪含量低，含有人体所需的多种脂肪酸，能够满足人们对高品质牛肉的需求[2-3]。牛肉富含多种氨基酸和矿物质元素，具有消化吸收率高等特点，深受人们喜爱[4]。近几年，随着居民消费水平的提高，对牛肉的消费量也越来越大，人们更加重视牛肉和牛肉制品的品质[5-6]。研究发现，肌纤维的形态特征（如肌纤维总数和肌纤维横截面积）与肌纤维的收缩及代谢特性是影响肉品质的主要因素[7-8]。

骨骼肌主要由不同类型的肌纤维组成，不同类型的肌纤维具有不同形态特征和收缩及代谢特性。根据氧化代谢酶[9]和肌球蛋白三磷酸腺苷酶（myosn adenosine triphosphatase，mATPase）的染色情况[10]分类，可以将肌纤维类型分为I型（慢速氧化型）、IIA型（快速氧化型）和IIB型（快速酵解型）。Lefaucheur等[11]利用免疫组化的方法将猪骨骼肌纤维类划分为I、IIA、IIB和IIX型，分别对应于慢速氧化型（I）、快速氧化型（IIA）、快速酵解型（IIB）和中间型肌纤维（IIX），其收缩速率为I＜IIA＜IIX＜IIB[12-13]。

影响骨骼肌中肌纤维类型组成、直径、面积比和数目比的因素很多，如性别、年龄、品种、激素和身体活动等，其中部位是一个重要因素。关于肌纤维特性和肉品质特性之间关系的研究在猪肉中较多，在反刍动物（如牛、羊）中的研究较少[14]。郎玉苗等[15]研究了中国西门塔尔牛背最长肌、腰大肌和半腱肌肌纤维特性和肉品质特性的关系，发现不同部位肌肉肌纤维特性可以影响牛肉品质。关于韩牛不同部位肌肉肌纤维特性和肉品质间的关系也有报道[16]。解祥学等[17]研究对比了利木赞牛、皮埃蒙特牛、中国西门塔尔牛、鲁西牛、秦川牛和晋南牛的肌纤维特性，发现不同牛种间也存在显著差异。王莉[18]研究了牦牛不同部位肌纤维特性对牛肉嫩度的影响，发现I型肌纤维比例越高，宰后嫩度改善效果越好，但鲜见牦牛肉背最长肌、腰大肌和半膜肌这3 个部位肌肉肌纤维特性和肉品质之间关系的相关报道。

因此本研究选取牦牛背最长肌、腰大肌和半膜肌为研究对象，采用酶组织化学染色法和实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法测定牦牛的肌纤维特性，包括肌纤维类型、直径、面积比和数目比，并测定了这3 个部位肌肉的剪切力、肌节长度、肉色、蒸煮损失率和pH值，以期从肌纤维角度解释不同部位肌肉的品质差异。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选取青海省海北州海晏县牦牛2～3 岁健康放牧公牛10 头，胴体质量（98.15±8.45）kg。

包埋剂 日本Sakura公司；Tris-base 美国Sigma公司；ATP钠盐 北京Solarbio公司；硝酸钴、硫化铵、二甲苯、蔗糖 国药集团化学试剂有限公司；Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBR®Premix ExTaq™（Tli RNaseH Plus）、RNAiso、RNase-free水 宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 仪器与设备

CRYOSTAR NX50型冰冻切片机 美国Thermo公司；819型切片刀 德国徕卡仪器有限公司；Eclipse E100型正置光学显微镜、DS-U3型成像系统 日本尼康公司；TA-XT2i型质构仪 英国Stable Micro Systems公司；SP62型便携式色度仪 美国爱色丽公司；实时荧光定量PCR仪、凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司；核酸测定仪德国Implen公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

牦牛宰后45 min分别取背最长肌、腰大肌和半膜肌1 cm×1 cm×2 cm样品后用锡纸包装后放置于液氮中保存，用于mATPase染色。取1 g肉柱于冻存管中，放入液氮中，然后转入－80 ℃超低温冰箱保存，用于提取RNA。在宰后48 h进行分割，取背最长肌、腰大肌和半膜肌放入泡沫箱（加冰袋）运回实验室（到达实验室为成熟第3天），用于品质指标的测定。

1.3.2 pH值的测定

用SenvonGo便携式pH计分别测定背最长肌、腰大肌和半膜肌的pH值，将pH计探头插入3 cm左右，当pH值稳定后读取数值，3 次重复取平均值[19]。

1.3.3 肉色的测定

取牦牛背最长肌、腰大肌和半膜肌上成熟3 d的肉样，在空气中发色30 min，用便携式色度仪测定L*、a*、b*值，测定6～8 个位点取平均值[19]。

1.3.4 剪切力的测定

参考Hou Xu等[20]的测定方法，分别从成熟3 d的背最长肌、腰大肌和半膜肌上取厚度约为2.5 cm的牛排样品，真空包装后80 ℃水浴加热至肉块中心温度70 ℃，之后0～4 ℃冷却过夜。用空心取样器（直径为1.27 cm）沿肌纤维方向取肉柱，注意避开筋腱和结缔组织，用TA-XT2i型质构仪的HDP/BSW探头测定肉柱的剪切力。

1.3.5 肌节长度的测定

参考Cross[21]与Li Ke[22]等的方法，并稍作修改。选取2 g牦牛肉样品，加入18 mL的0.25 mol/L蔗糖溶液（提前放于4 ℃预冷），低速匀浆（转速约为6 000 r/min）1 min，用悬浮液制作载玻片，在光学显微镜下放大1 000 倍观察并拍照。每个样品取5 个平行，选取30 张照片，用Image-Pro Plus Version 6.0软件测量肌节长度，测量结果的平均值即为该样品的肌节长度。

1.3.6 蒸煮损失率的测定

分别取牦牛背最长肌、腰大肌和半膜肌的肉样称其质量（m1），包装后将温度计插入肉的中心部位，80 ℃水浴加热肉块至中心温度70 ℃，在室温冷却20 min后放于0～4 ℃过夜，取出肉块，表面汁液用滤纸吸干，称质量（m2）[19]。蒸煮损失率按下式计算。

1.3.7 组织化学分析测定肌纤维指标

参考Brooke等[10]的方法，并稍加修改。将牦牛肉用冷冻切片机切成10 μm的新鲜切片，进行碱孵育mATPase染色。5 g Tris-base加入0.449 g CaCl2，加入蒸馏水，定容至250 mL，用0.1 mol/L盐酸溶液调pH值至10.4。再配制pH 9.4工作液，每10 mL加15 mg的ATP钠盐，充分溶解，调节pH值至9.4。将未经固定的新鲜组织冰冻切片自然晾干，在pH 10.4的工作液中孵育5 min，倾去孵育液，在pH 9.4的工作液中孵育30 min，倾去孵育液，用CaCl2溶液清洗3 次，每次2 min。再用质量分数1%硫化铵溶液处理30 s，流水冲洗5 min。将切片依次浸入无水乙醇3 次，每次5 min；后浸入二甲苯2 次，每次5 min，中性树胶封片，在显微镜下观察，采集图像。

1.3.8 基因相对表达量测定

按照动物组织RNA提取试剂盒说明书提取背最长肌、腰大肌和半膜肌的RNA。对提取的牦牛总RNA用微量核酸蛋白测定仪分析测定OD260nm/OD280nm及其质量浓度，对符合质量要求的RNA进行反转录。根据试剂盒的说明步骤去除总RNA样品中残存的基因组DNA，反转录成cDNA，反应体系20 μL，反应程序为37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃保温，之后将cDNA放入－20 ℃冰箱保存，用于实时荧光定量PCR测定。本实验选取甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参基因，MYH7、MYH2、MYH1、MYH4为目的基因，分别编码肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MyHC）-I、MyHC-IIa、MyHC-IIb和MyHC-IIx，全部实时荧光定量PCR引物由宝生物工程（大连）有限公司设计合成，引物序列如表1所示。

表 1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

实时荧光定量PCR反应体系25 μL，按照试剂盒要求进行PCR反应液的配制，每个反应管3 个平行。反应程序参照试剂盒说明书。采用操作相对简便的2－∆Ct法作为相对基因表达量的分析方法[23]，标准曲线通常被用来确定实时荧光定量PCR反应的扩增效率，目的基因相对于内参基因的表达为ΔCt，ΔCt＝Ct（目的基因）－Ct（GAPDH）。

1.4 数据处理与分析

采用Bio-Rad CFX Manager软件对荧光定量基因表达数据进行相对定量处理以及分析基因的相对表达量。采用Image-Pro Plus version 6.0软件测定肌节长度和肌纤维数据。数据用SAS 9.0软件进行统计分析，品质指标以肌肉部位为固定效应进行单因素方差分析；肌纤维直径、面积比、数目比和基因相对表达量以肌纤维类型和肌肉部位为固定效应进行两因素的方差分析。数据用平均值±标准差表示。用SPSS 18.0软件的皮尔森相关性分析来描述肌纤维特性和肉品质性状之间的相关性。采用Sigma Plot 12.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同肌肉部位品质指标分析

如表2所示，牦牛不同肌肉部位间的品质指标存在明显差异。3 个肌肉部位的pH值在5.4～5.7范围内，腰大肌的pH值显著高于背最长肌和半膜肌（P＜0.05）。肉色是影响消费者购买的主要因素，3 个肌肉部位的L*值没有显著性差异（P＞0.05），腰大肌的a*值显著高于背最长肌（P＜0.05），这与前人研究结果一致，其发现腰大肌含有较高的肌红蛋白含量，且线粒体含量丰富[16]。腰大肌剪切力显著低于背最长肌和半膜肌（P＜0.05），剪切力背最长肌＞半膜肌＞腰大肌，同时腰大肌的肌节长度为2.1 μm，显著高于另两个部位（P＜0.05），由此说明腰大肌嫩度优于背最长肌和半膜肌。蒸煮损失率是反映牛肉保水性的一个重要指标，研究表明极限pH值对牛肉保水性具有一定影响[24]，pH值下降造成的乳酸积累会破坏蛋白质与水的结合并造成肌丝表面静电荷的减少，从而不利于水分的保持。本研究发现半膜肌的pH值较低，同时蒸煮损失（27.2%）显著高于背最长肌和半膜肌（P＜0.05），由此说明半膜肌的保水性较差，而背最长肌保水性较好。总体来看，综合剪切力、肉色、蒸煮损失率、肌节长度和pH值的结果，腰大肌肉色较红、嫩度较好，更能满足人们对高品质牛肉的需求。

表 2 牦牛肉背最长肌、腰大肌和半膜肌品质指标分析Table 2 Meat quality traits of yak Longissimus lumborum, Psoas major and Semimembranosus

2.2 酶组织化学染色法分析肌纤维特性

图 1 牦牛肉背最长肌、半膜肌和腰大肌ATPase组织化学染色Fig. 1 Histological sections of three muscles stained for myosin ATPase activity

图 2 牦牛肉肌纤维特性分析Fig. 2 Myofiber characteristics of yak meat

图1和图2所示为牦牛3 个肌肉部位的肌纤维特性。如图2A所示，腰大肌肌纤维直径（23.9 μm）显著低于另两个部位（P＜0.05），I型肌纤维直径和肌纤维面积比均显著低于II型肌纤维（P＜0.05）（图2B、C）。有研究指出不同肌肉中的肌纤维组成不一，对肉的嫩度会产生一定影响。对于同一品种、同一部位肌肉而言，肌纤维直径越粗，横截面积越大，肉块测得的剪切力就越大，肉的嫩度就越差[25]。肌肉部位和肌纤维类型的交互作用显著影响肌纤维数目比（P＜0.05），腰大肌I型肌纤维数目比为50.8%，显著高于另两个部位（P＜0.05），其中背最长肌最低，为27.2%，这与Hwang等[26]的研究结果一致，其报道指出韩牛腰大肌具有较高比例的I型肌纤维数目比，较低比例的IIB型肌纤维数目比。

有研究指出基于mATPase和代谢酶分类可能存在不一致性，因为所使用组织化学反应强度不同，并且这种方法难以从混合肌纤维IIA/X中分出单一肌纤维类型，在碱性mATPase染色结果中强烈反应的可能是IIA/X混杂纤维[27]，故本研究只根据肌纤维的收缩特性分为II型肌纤维和I型肌纤维，然后测量肌纤维类型的数目比、面积比以及肌纤维直径。本研究结果说明不同部位牦牛肉肌纤维的特性差异显著。

2.3 实时荧光定量PCR法分析肌纤维特性

图3结果显示背最长肌、腰大肌和半膜肌3 个肌肉部位均呈现肌球蛋白重链的3 种亚型，即MyHc-I、MyHc-IIa和MyHc-IIx。不同肌肉部位中这几种亚型的基因相对表达量不同。图3A为牦牛这3 个部位的MyHcmRNA相对表达量，可以看出腰大肌和半膜肌MYH7mRNA相对表达量均显著高于MYH2和MYH1（P＜0.05），而背最长肌这几种基因的mRNA相对表达量没有差异，其中腰大肌MYH7mRNA的相对表达量显著高于背最长肌和半膜肌（P＜0.05）。图3B为mRNA相对表达量所占比例，可以看出腰大肌MYH7mRNA相对表达量所占比例较高，其次为半膜肌和背最长肌。这与前面肌纤维染色结果相一致，由此可以得出腰大肌的I型肌纤维较II型肌纤维数目较多。通过实时荧光定量PCR技术来分析牦牛这3 个肌肉部位的肌球蛋白重链（MyHc）mRNA的相对表达量，验证了牦牛背最长肌、腰大肌和半膜肌中II型肌纤维和I型肌纤维的比例。此外本研究表明MYH4mRNA在牦牛这3 个肌肉部位中未表达，这与前人研究结果相似，有研究指出在大多数牛种中，并没有在其骨骼肌中发现MYH4mRNA的表达，仅在个别牛种眼肌中发现过其表达[28]。

图 3 背最长肌、腰大肌和半膜肌肌纤维相关基因mRNA表达量（A）和不同基因mRNA相对表达量所占比例（B）Fig. 3 Relative mRNA expression levels of myofiber-related genes (A)and their distribution (B) in Longissimus thoracis, Psoas major and Semitendinosus

2.4 肌纤维特性和品质指标相关性分析

表3显示牦牛肉肌纤维特性和肉品质指标之间的相关性。本研究结果表明II型肌纤维数目比与剪切力呈极显著正相关，而II型肌纤维和I型肌纤维直径均与剪切力呈显著正相关，与肌节长度呈显著负相关。I型肌纤维数目比和面积比与肌节长度呈显著正相关，相反地，II型肌纤维数目比和面积比与肌节长度呈显著负相关。

肌纤维是骨骼肌的基本构成单位，肌纤维的生物学特性与肉品质如嫩度、pH值和肉色直接相关，肌纤维的类型、数目和直径对肉品质有重要影响[14]，其中嫩度是决定肉品质的一个重要因素，研究指出不同肌纤维类型的组成及直径对肉的嫩度具有一定的影响，一方面肌纤维类型、直径、横截面积等方面与肉的嫩度间存在相关性，肌纤维的直径越小，肉嫩度也越好；另一方面，不同的肌纤维类型造成了其结缔组织和肌内脂肪的含量不同，从而也影响了肉的嫩度，但目前关于牛肉嫩度和肌纤维特性的关系仍存在争议[29-30]。王莉[18]报道牦牛I型肌纤维比例越高，嫩度越好，与本研究结果一致，因此可以通过增加I型肌纤维的比例来改善肉的嫩度。

表 3 牦牛肉肌纤维特性与3 种部位肌肉品质相关性分析Table 3 Correlation coefficients between myofiber characteristics and meat quality traits for three yak muscles

I型和IIA型肌纤维均包含较多的肌红蛋白含量[8]，从而导致肉色较红，但在本研究中没有将II型肌纤维明确分类为IIA和IIB型，故肌纤维特性和a*值之间没有相关性，而II型肌纤维面积比与L*值呈显著正相关（r＝0.516；P＜0.05）。肌肉中肌纤维类型的组成对宰后蛋白质的降解、糖酵解速率以及pH值下降速率有一定的影响，快收缩IIB型肌纤维含有高的糖酵解纤维，导致其在宰后早期代谢速率较快。如果快速收缩酵解型肌纤维在肌肉中占主导，则会诱导快速糖酵解，造成肌肉中pH值的快速降低，从而导致汁液渗出，这在猪肉研究中比较常见，这是由于猪肉较牛肉含有更高比例的II型肌纤维；然而在本研究中并没有发现pH值和肌纤维特性之间存在显著的相关性。II型肌纤维数目比与蒸煮损失率呈显著负相关（r＝－0.554，P＜0.05）。以上结果表明，牦牛3 个部位的肌纤维特性和肉品质是密切相关的。

3 结 论

牦牛背最长肌、腰大肌和半膜肌品质指标差异明显，其中腰大肌的pH值和a*值较高，嫩度优于背最长肌和半膜肌，而背最长肌的保水性较好，腰大肌居中，总体来说腰大肌的肉品质较好。3 个肌肉部位的肌纤维特性差异显著（P＜0.05），其中背最长肌和半膜肌具有较高比例的II型肌纤维，而腰大肌具有较高比例的I型肌纤维和较小的肌纤维直径。I型肌纤维的数目比和面积比与肉品质性状存在一定的相关性。肌纤维数目比与剪切力呈负相关，与肌节长度、蒸煮损失呈正相关，而肌纤维面积比与L*值呈显著负相关。II型肌纤维和I型肌纤维直径均和肉的嫩度密切相关（与剪切力呈正相关和肌节长度呈负相关）。本研究结果表明牦牛的肌纤维特性可以作为衡量牦牛不同肌肉部位品质的重要指标，可以通过提高肌肉中I型肌纤维的所占比例，来改善牦牛肉的品质。