一种假单胞菌Pseudomonas sp.导致的侧耳属细菌病害*

柴红梅，张小雷，赵永昌，苏开美，陈卫民

（云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南 昆明 650205）

假单胞菌属细菌是主要的食用菌病菌，能引起平菇 （Pleurotus ostreatus）、双孢菇 （Agaricus bisporus）、香菇 （Lentinula edodes）、金针菇 （Flammulina velutipes）等的褐斑病[1-4]，其繁殖速度快、传播范围较广，容易给食用菌栽培场造成极大的损失。因此，及时鉴别危害病菌的种类和特征、较早预防，可以有效减轻病菌危害。

在食用菌栽培生产中，目前已知的最为普遍的细菌性病原菌为托拉斯假单胞杆菌（Pseudomonas tolaasiiPaine），它能通过产生一种脂多糖类的细胞外毒素tolaasins，有效地破坏食用菌的细胞膜结构，致使细胞破裂[5-6]，受感染的子实体表面发粘腐烂并发生褐变。托拉斯假单胞杆菌能侵染多种栽培食用菌，其传播介体为空气、土壤、带病子实体、昆虫等，能够在较短时间内感染子实体、产生病斑并快速蔓延。除了托拉斯假单胞杆菌，荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）[7]、铜绿假单胞菌 （Pseudomonas aeruginosa）[8]、洋葱假单胞菌 （Pseudomonas cepaica）[9]、施氏假单胞菌 （Pseudomonas stutzeri）[10]及绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）[11]等也都会对不同的食用菌造成比较大的危害。从平菇和双孢菇中分离到了托拉斯假单胞菌、荧光假单胞菌和Pseudomonas gingeri[12-13]。另外，在河南的杏鲍菇子实体中发现细菌性病害，表现为子实体畸形，菌肉呈水渍状，并逐步腐烂，但没有鉴定出该病原菌的种类[14]。

尽管已有多种方法被用来进行假单胞病原菌的杀灭，包括喷洒二氧化氯、次氯酸钙及链霉素等，但病变发生后很难彻底控制病原菌，因此提前检测菇房环境并进行阻断，更有利于后期的生产开展。统计病原菌种类，掌握其生物学特征，特别是DNA序列，可以有效的进行类别鉴定。本研究从云南陆良平菇及杏鲍菇种植场分离获得了2株假单胞杆菌菌株，分离纯化后，扩增其16S rDNA片段，进行序列分析和分类地位分析，为假单胞病原菌在分子水平的研究提供了数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从云南陆良种植场采集感染病菌的平菇（P.ostreatus）和杏鲍菇（P.eryngii）子实体，分别挑取一个染病部位的菌斑置于无菌水中，吸取菌液涂布到酵母膏胨葡萄糖培养基（蛋白胨0.2%、酵母粉0.2%、葡萄糖2%、琼脂粉1.5%，pH自然） 固体平板，培养获得单菌落，保存备用。

1.2 PCR扩增及序列测定

用扩增细菌16S rDNA的通用引物对16SF（5’-AACTGAAGAGTTTGATCCTGGCTC-3’） 和 16SR（5’-TACG GTTACCTTGTTACGACTT-3’） 扩增菌株的16S rDNA片段。平菇和杏鲍菇样品所分离的2株病原菌落中，都分别随机挑选3个菌落，进行菌落PCR。反应体系为：2×Power Taq PCR Master Mix 25 μL（天根生化科技有限公司），10 μmol·L-1引物各2 μL，DNA模板1 μL，无菌去离子水补足50 μL。扩增在BIO-RAD公司的C1000TM Thermal Cycler PCR扩增仪上进行，程序如下：95℃预变性10 min；95℃变性 30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸 1 min 30 s，35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，对符合预测大小的片段胶回收后进行测序。本试验所用引物的合成及PCR产物序列测定均在昆明硕擎生物技术有限公司完成。

1.3 序列特征及聚类分析

采用DNAStar软件包SeqMan程序对所得16S rDNA序列进行拼接，并提交GenBank进行Blast搜索，从而获得近缘种的相似序列。采用ClustalX程序比对拼接序列，去除两端长短不一和模糊的部分，使序列长度基本一致。采用Mega 4软件中的邻接法（Neighbor JoiningAnalysis，NJ）构建系统发育树。在分析过程中，将Alignment序列中出现的空缺视为信息丢失。采用自举法进行分支支持率分析，设1000次重复。

2 结果与分析

2.1 细菌侵染子实体特征

在云南陆良种植场出现了大面积的平菇和杏鲍菇病害，从图1可以看出，平菇显现出褐腐病特征，受感染子实体表面发粘，出现淡乳白色菌落，然后子实体发软萎缩，并且发生褐变；杏鲍菇子实体发病时表面先出现水渍状的斑点，从里到外腐烂并渗出淡褐色液体，之后整个子实体完全消解。另外，该病原感染初期还能造成原基的发育畸形。

图1 病原菌株Pseudomonas sp.造成的平菇（A） 和杏鲍菇（B） 病害Fig.1 Diseases of Pleurotus ostreatus(A)and Pleurotus eryngii(B)caused by Pseudomonas sp.

2.2 病原菌的分离及分子鉴定

所采集的病原菌经稀释、平板涂布后挑取单菌落。从平菇和杏鲍菇所获病原菌菌落中，各随机选择3个菌落进行后续的PCR扩增。

图2 病原菌株Pseudomonas sp.的16S rDNA核酸序列Fig.2 16S rDNA sequences of Pseudomonas sp.

使用特异性引物16S F/R，每个菌株扩增获得1个特异性片段，胶回收后进行测序。片段含有800多个碱基，去除两端模糊序列后，序列长度为734 bp（图2）。Clustal X比对发现，从平菇及杏鲍菇分离到的病原菌菌株的16S rDNA序列完全一致，表明它们为同一个种。序列提交GeneBank blastn分析显示，与假单胞属各近似物种的相似度从99.26%到99.56%。根据16S rDNA分析，可确定所获病原菌为假单胞菌属，但不能确定具体种。

2.3 病原菌株的系统分析

所分离病原菌Pseudomonassp.与同属近缘种的16S rDNA序列作聚类分析（图3），结果显示其与P.gessardii、P.fluorescens、P.reactans、P.azotoformans等物种能更好的聚在一起，而与常见的P.tolaasii亲缘关系较远。

图3 Pseudomonas 16S rDNA系统聚类图Fig.3 Phylogeny of Pseudomonas based on 16S rDNA

3 结论

假单胞菌属多种菌为食用菌的主要细菌性病原菌，这些病原菌具有传播范围广、发病速度快等特点，给栽培场带来极大的危害。快速鉴定病原菌种类并提前预防可以有效减轻危害带来的损失，而利用核酸序列进行分析是一个快捷鉴定病原菌的途径。16S rDNA核酸片段测定已经被广泛用于细菌物种鉴定，因此本研究使用该方法来对病原菌株进行鉴定。此外，由于细菌通过形态难以进行区分，还需要后续的生理生化试验进行深入研究。

本研究中从平菇和杏鲍菇感染子实体中分离了假单胞病原菌株Pseudomonassp.，其16S rDNA序列与其他假单胞菌属真菌相似性最高为99.56%，而聚类结果表明，它与P.gessardii、P.fluorescens、P.reactans、P.azotoformans等物种的亲缘性大于P.tolaasii。目前并不能确定这个菌株为假单胞属的哪一个种，其具体的分类地位仍需后续的生理生化试验进行证实。

根据序列分析结果，本研究中所获得的菌株异于常见的托拉斯假单胞菌，而且该菌能侵染平菇及杏鲍菇，说明其寄主具有广泛性。以前的研究极少有杏鲍菇病原菌相关报道，在此次的研究中，发现并鉴定了假单胞菌相关种侵染杏鲍菇并造成病害的相关特征，为杏鲍菇的种植及病害防治提供了有用的信息。至于其它地区关于杏鲍菇病害特征的描述，由于缺乏核酸信息等方面的证据，不能判断是否为假单胞菌属相关物种所造成[14]，需要进一步予以证实。这是从杏鲍菇分离到假单胞菌为数不多的相关研究之一，给相关病原菌的鉴定及防治提供了有效支撑，同时也为食用菌细菌性病害研究提供了重要的信息。

此外，根据该病原菌与同属其它种的16S rDNA序列相似度比对来看，假单胞菌作为食用菌的主要病害，其各个种极为相似，因而需要结合生理生化特征对该属物种进行准确鉴定，并明确各个种的寄主和造成病害的特征，以便为病害的鉴定及防治提供指导，减轻病原菌给食用菌种植带来的危害。