新疆天山山脉地区野生羊肚菌ITS分析鉴定*

易思华，张 媱，孙燕飞，李 杨，冯 丽

（石河子大学生命科学学院，新疆 石河子 832000）

羊肚菌隶属子囊菌亚门（Ascomycotina） 盘菌纲（Discomycetes） 盘菌目 （Peziales） 羊肚菌科（Morchellaceae） 羊肚菌属 （Morchella）[1]，是世界性分布的名贵稀有食用菌，具有较大的食用和药用价值，因此被人们所广泛喜爱。因其子实体菌盖呈“蜂窝”状，形似羊肚而得名羊肚菌[2]。

新疆天山山脉地区得天独厚的地理条件为羊肚菌提供了良好的生长环境，拥有丰富的野生羊肚菌资源[3]。该地区野生羊肚菌分布范围广泛，普遍生长于海拔800 m～2 300 m的山坡、低山和中山处；生境多为针叶林、阔叶林、混交林常见的阔叶林有栎树、白桦、柳树等，针叶树主要树种有冷杉、油杉、云杉等[4]；有时在林缘草地及河滩草地，甚至在腐朽的树根周围、溪边、岩石旁等处也常常能找到羊肚菌的“踪迹”[5]。

传统的形态学分类方法，根据菌盖中部与菌柄是否分离、菌盖边缘是否明显向外伸展、菌盖的形状和颜色、菌盖棱纹排列和凹坑的深浅等性状，可以进行初步鉴定[6]。有关新疆野生羊肚菌的分类研究，大多采用常规形态学原理分类，但因野生羊肚菌在生长过程中子实体形态受环境影响会发生很大变化，导致了分类不准确。随着分子生物学技术的发展，真菌分类和系统发育研究也发生了革命性的变革[7]，近年，ITS（internal transcribed spacer） 技术广泛应用于真菌分类及系统发育的研究。菌物学家将羊肚菌属分为三大类，即黑色羊肚菌类、黄色羊肚菌类和半开羊肚菌类[8]，而新疆野生羊肚菌已鉴定出的有小羊肚菌、高羊肚菌、羊肚菌、高柄羊肚菌、黑脉羊肚菌、离柄羊肚菌等[9]；赵震宇[10]在《新疆食用菌志》中记录了黑脉羊肚菌，圆锥羊肚菌、羊肚菌、小羊肚菌、皱柄羊肚菌；卯晓岚[11]在《中国大型真菌原色图鉴》中记录了新疆地区黑脉羊肚菌、尖顶羊肚菌、羊肚菌、粗腿羊肚菌、高羊肚菌。总体来说，文献报道新疆地区发现并鉴定出来的野生羊肚菌大多都分布于新疆伊犁、乌鲁木齐、石河子、塔城、阿勒泰、哈密地区[12-19]。本试验中，以2016年～2018年间采自新疆石河子、呼图壁、阜康、伊犁、沙湾地区的部分羊肚菌为材料，提取其基因组DNA，进行ITS序列比对分析，构建进化树，深入探究了新疆野生羊肚菌菌株的种属及分类地位，确定了新疆地区未鉴定的野生羊肚菌资源，旨在进一步明确新疆地区野生羊肚菌资源分布，以便为实现新疆地区野生羊肚菌的驯化、育种及商业化人工栽培奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 野生羊肚菌菌株及来源

2016年～2018年4下旬至6月中旬，赴新疆石河子、呼图壁、阜康、伊犁、玛纳斯、沙湾地区采集到52株野生羊肚菌，从中选择10株样品进行详细分析，依次编号为M1～M10，样品采集地生境信息见表1。

表1 野生羊肚菌样品采集地生境Tab.1 Habitat of wild Morchella samples

1.1.2 主要试剂

2×Easy Taq Mix（北京康为世纪生物公司）、Gold view（北京索莱宝科技有限公司）、ITS1[5’-(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)-3’]、ITS4[5’-（CAGG AGACTTGTACACGG）-3’]引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 野生羊肚菌形态学初步鉴定

观察野生羊肚菌子实体形状、大小、颜色和脉纹等形态特征，参照《大型真菌图鉴》[20]，初步鉴定52份野生羊肚菌。选择其中10株进一步进行ITS分析。

1.2.2 组织分离与纯化

将10个羊肚菌子实体冲洗干净、晾干。在超净工作台中，用75%酒精反复缓慢冲洗子实体30 s，后用无菌水冲洗3次，用无菌吸水纸将子实体表面水分吸干。使用无菌的手术刀片切取子实体内部组织，接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）试管斜面上，室温、黑暗培养1周后挑取菌丝生长点部位转接至新的PDA试管中，直至培养基中无杂菌生长，即获得野生羊肚菌纯菌丝。

1.2.3 菌株基因组DNA提取

采用CTAB改良法，从试管斜面刮取50 mg左右菌丝体于2 mL无菌EP管中，加入CTAB抽提液500 μL 与酚和氯仿-异戊醇 （24∶1） 各 250 μL，并加入适量无菌石英砂，置于280 r·min-1摇床中常温抽提40 min；12 000 r·min-1室温离心10 min后，小心吸取上清液600 μL于1.5 mL无菌EP管中，加入3 mol·L-1醋酸钠 60 μL 与异丙醇 660 μL，混匀后室温沉淀2 h；10 000 r·min-1离心5 min，弃上清；加入 70%乙醇 200 μL漂洗，10 000 r·min-1离心 5 min，弃上清；加入200 μL无水乙醇漂洗，10 000 r·min-1离心5 min，弃上清；超净工作台中吹干，加入无菌水30 μL溶解，冰箱-20℃保存备用。

1.2.4 ITS 区扩增及 ITS 测序

ITS-PCR扩增反应体系为20 μL：2×Easy Taq Mix 10 μL、ITS1和 ITS4 引物各 1 μL、模板 DNA 2 μL、ddH2O 6 μL。PCR程序设定为：预变性，94℃，10 min；变性，94℃，1 min；退火，56℃，45 s；延伸，72℃，1 min；延伸，72℃，10 min；30个循环。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用凝胶成像仪拍照，最后将PCR产物送生物技术公司测序。

1.2.5 构建系统进化树

利用 MEGA 6.0、Align by-ClustalW 程序进行多序列比对，手动删除不合群序列[21]，选择Neighbor-Joining法构建进化树[22]，选择Bootstrp method作为构建进化树的检验方法[23]，检验次数设置为1 000，遗传距离计算模型设置为p-diatance,选择pairwise处理序列中的空位与缺失，得出构建的进化树。

2 研究结果与分析

2.1 野生羊肚菌子实体形态特征

野生羊肚菌子实体形态特征见图1。

图1 野生羊肚菌子实体性状Fig.1 Wild Morchella sporocarp characters

如图1所示，野生羊肚菌的生长对周围环境条件要求极为苛刻，由于新疆不同地区气候差异较大，采集自新疆石河子、呼图壁、阜康、伊犁、玛纳斯、沙湾地区的羊肚菌子实体形态也各有差异。

对初步分类所得的10株野生羊肚菌进行子实体特征描述，详见表2。

如表2所示，样品M3、M4、M8的菌盖形状为球状，顶端呈椭圆状；样品M2、M3、M4、M5、M6、M7的菌盖颜色均为黑色，样品M1、M8、M9、M10的菌盖颜色均为黄色，10个样品菌盖与菌柄长度比基本一致。

2.2 ITS扩增分析

根据Wipf[24]等对黄色羊肚菌和黑色羊肚菌ITS序列的研究，可知黑色羊肚菌的ITS序列长度在740 bp～750 bp之间；黄色羊肚菌的ITS序列长度在1 150 bp～1 220 bp之间。10个样品的PCR检测结果见图2。

由图2可知，本试验中样品M8、M9、M10在1 100 bp左右有明亮且清晰的条带；样品M6、M7在750 bp左右有明亮且清晰的条带，与Wipf所报道的结果基本一致。

2.3 进化树分析

样品的系统发育树见图3。

表2 野生羊肚菌样品形态特征Tab.2 Morphological characteristics of wild Morchella samples

图2 野生羊肚菌样品ITS片段检测结果Fig.2 Amplified ITS fragment of wild Morchella samples

图3 基于ITS序列构建的羊肚菌菌种间系统发育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of Morchella species based on ITS sequences

如图3所示，以皱盖钟菌（Verpa bohemica） 作为外群，进化树的根部分支出黑色羊肚菌支系（group 1）、黄色羊肚菌支系（group 2） 和外群3支。通过系统发育树分析，羊肚菌M8、M9、M10均聚类在黄色羊肚菌支系（group 2） 上，即推断其都属于黄色羊肚菌。其中羊肚菌M8以76%的Bootstrap聚在羊肚菌（Morchella Mes-X） 分支上，说明M8的ITS序列与羊肚菌极为相似，而羊肚菌属于黄色羊肚菌，由此可进一步确定M8为黄色羊肚菌[25]。羊肚菌M9以100%的Bootstrap聚在美味羊肚菌（Morchella esculenta）分支上，说明它们之间亲缘关系较近，可确定羊肚菌M9就是美味羊肚菌。编号为M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7的羊肚菌均聚类在黑色羊肚菌支系（group 1） 上，它们都属于黑色羊肚菌。其中采自沙湾鹿角湾地区的羊肚菌M7以81%的Bootstrap聚在高羊肚菌（Morchella elata)分支上，可确定M7是高羊肚菌；羊肚菌M5以100%的Bootstrap聚在黑脉羊肚菌（Morchella angusticeps)分支上，可确定M5是黑脉羊肚菌。采自阜康地区的羊肚菌M6以100%的Bootstrap聚在梯棱羊肚菌（Morchella importuna)分支上，表明M6的ITS序列与梯棱羊肚菌的ITS序列之间差异很小，可确定羊肚菌M6为梯棱羊肚菌。

3 讨论

目前，传统经典形态分类学方法已经非常完善了，但因羊肚菌的生长对周围生长环境条件极其敏感，子实体形态不一，使用传统经典形态分类学以及单一的ITS序列鉴定常常不准确，因此要求我们寻求更多更可靠的办法为羊肚菌的分类研究提供新的更可信的依据，该结论在韩鹏远等[26]在山西中南部地区羊肚菌资源研究中也得到证实，现在可采用rpb1、rbp2、ef1-α等多基因片段联合，进行野生羊肚菌更加准确的物种界定[27]。

本试验采自伊犁察布查尔县地区的野生羊肚菌M5是黑脉羊肚菌（Morchella angusticeps)，鉴定结果与武冬梅采自伊犁察布查尔县的羊肚菌一致；目前新疆石河子采集并鉴定的野生羊肚菌有2种，即尖顶羊肚菌、黑脉羊肚菌，本试验采自石河子不同地区的野生羊肚菌M9鉴定为美味羊肚菌（Morchella esculenta），该种羊肚菌在新疆石河子地区从未报道过。

新疆北部地区各地特殊的小气候为羊肚菌的发生提供了良好条件，因此新疆地区成为了我国羊肚菌资源和种类最丰富的地区之一，羊肚菌产业在新疆地区具有巨大潜力。目前，对新疆地区羊肚菌的研究正处于探索阶段，深入而广泛的野生羊肚菌资源调查是非常必要的。

4 结论

本试验中采用传统经典形态学分类与核糖体DNA转录间隔区（ITS） 序列分析技术结合的方法，确定羊肚菌M8（MK752768）、M10（MK757602） 均属于黄色羊肚菌，M9（MK757633）是美味羊肚菌；羊肚菌 M1（MK757636）、M2（MK757644）、M3（MK757642）、M4（MK757646） 均属于黑色羊肚菌。M5 （MK757657） 是黑脉羊肚菌；M6 （MK757608）是梯棱羊肚菌；M7（MK757626）是高羊肚菌，新疆天山山脉地区野生羊肚菌资源丰富。