DLPME-HPLC法同时测定人血清中维生素A和维生素E含量

张小敏 王洁 王淑静 朱佳佳

摘要：目的  建立分散液相微萃取（DLPME）-高效液相色谱（HPLC）同时测定人血清中维生素A、E含量的方法。方法  2018年5月随机抽取人血液样本50例，经DLPME技术处理后，采用HPLC对人血清中维生素A、E含量进行检测，使用标准曲线法进行定量分析。结果  维生素A标准曲线方程为y=13225x+410.03，相关系数为0.9998，检出限为0.042 μg/ml;维生素E标准曲线方程为y=1383.9x-458.27，相关系数为0.9997，检出限为0.096 μg/ml。维生素A和维生素E的加标回收率分别为90.12%～103.70%和81.09%～92.21%，含量范围分别为（0.62±0.04）μg/ml和（8.41±0.43）μg/ml。结论  DLPME-HPLC法操作简便，节约试剂，对样本富集效率高，通过该方法的研究，对微量血清中维生素A和维生素E的测定具很好的的应用价值。

关键词：分散液相微萃取;高效液相色谱;人血清;维生素A;维生素E

中圖分类号：R151.2                                 文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.20.051

文章编号：1006-1959（2019）20-0161-03

Simultaneous Determination of Vitamin A and Vitamin E in Human Serum by DLPME-HPLC

ZHANG Xiao-min，WANG Jie，WANG Shu-jing，ZHU Jia-jia

Abstract：Objective  To establish a method for simultaneous determination of vitamin A and E in human serum by dispersive liquid phase microextraction （DLPME）-high performance liquid chromatography （HPLC）. Methods  In May 2018， 50 human blood samples were randomly selected. After treatment with DLPME technique， the contents of vitamin A and E in human serum were detected by HPLC and quantified by standard curve method.Results  The standard curve of vitamin A was y=13225x+410.03， the correlation coefficient was 0.9998， the detection limit was 0.042 μg/ml; the standard curve of vitamin E was y=1383.9x-458.27， the correlation coefficient was 0.9997， and the detection limit was 0.096 μg/ml. The recoveries of vitamin A and vitamin E were 90.12%～103.70% and 81.09%～92.21%， respectively， and the contents ranged from （0.62±0.04）μg/ml and （8.41±0.43）μg/ml.Conclusion  DLPME-HPLC method is easy to operate， saves reagents， and has high efficiency of sample enrichment. The research of this method has a good application value for the determination of vitamin A and vitamin E in trace serum.

Key words：Dispersive liquid phase microextraction;High performance liquid chromatography;Human serum;Vitamin A;Vitamin E

维生素（vitamin）是生物体所需要的微量营养成分，维生素A和维生素E是维持人体正常代谢功能所必须的维生素，在自身体内无法自行合成，需要通过饮食等手段获得[1]。维生素A和维生素E均属于脂溶性的醇类物质，维生素A可维持上皮细胞的正常代谢，促进免疫球蛋白的合成;维生素E能够抑制脂肪酸的氧化，减少脂褐质的形成，并保护细胞免受自由基的损害，具有抗衰老、保护皮肤等作用[2]。日常生活中，人体对维生素的需要量较小，常以毫克或微克计算，但一旦缺乏就会引发相应的维生素缺乏症，对人体健康造成损害。因此，测定人血清中维生素A和维生素E对于维生素缺乏诊断具有重要意义。分散液相微萃取-高效液相色谱（DLPME-HPLC）是一新型前处理技术，该方法及采样、萃取和浓缩为一体，具有操作简单、快速、效率低等特点。本文主要建立DLPME-HPLC同时测定人血清中维生素A、E含量的方法，现报道如下。

1材料与方法

1.1材料  2018年5月于宁夏医科大学附属医院随机抽取正常学生体检血液样本50例，其中男25例，女25例，年龄22～27岁，平均年龄（23.60±1.40）岁。

1.2仪器与试剂  高效液相色谱仪（D2000，日立），C18反相色谱柱（依利特C18 ODS柱，4.6 mm×25 cm，5.0 μm），同类型保护柱;WH-0微型漩涡混合仪;台式高速离心机（日立）。维生素A（视黄醇）标准品（Sigma，>99%），维生素E标准品（Sigma，>95%）;二氯甲烷（色谱纯）、三氯甲烷（色谱纯）;甲醇（色谱纯），实验用水为优普超纯水（18.25 MΩ·cm）。

1.3实验方法

1.3.1色谱条件  色谱柱为依力特C18反相色谱柱;流动相为甲醇∶水=98∶2;流速为0.8 ml/min，柱温为50℃;紫外检测波长：维生素A最佳吸收波长为325 nm，维生素E最佳吸收波长为290 nm。采用日立D-2000液相色谱仪完成，应用切换波长程序，实现维生素A、维生素E的同时测定。

1.3.2标准样品制备及标准曲线的绘制  ①标准样品制备：分别用甲醇配置维生素A标准储备液（1 mg/ml），维生素E标准储备液（2 mg/ml）于-20℃冰箱冷藏保存;维生素A和维生素E混合标准应用液（维生素A：1 μg/ml，维生素E：5 μg/ml）：测定前，对维生素A和维生素E标准储备液浓度进行标定，再以其实际浓度用甲醇稀释成混合液。②标准曲线绘制：取维生素A和维生素E的混合液，通过控制色谱仪进样体积，分别进样2、5、10、20 μl，维生素A和维生素E的标准色谱图见图1。

1.4样品的处理和测定  测定前取样品20 μl至200 μl EP管里，加入50 μl甲醇溶液作为蛋白沉淀剂，漩涡混匀后，加入萃取剂，三氯甲烷50 μl、超声发生波萃取4 min，以10000 r/min离心5 min，吸取底部萃取液，使用0.45 μm的滤膜过滤之后，按色谱设置条件进行测定。

1.5统计学方法  采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，人血清样本维生素A和维生素E含量以（x±s）表示。

2结果

2.1条件优化结果

2.1.1萃取剂的选择  本实验选取了三氯甲烷和二氯甲烷做微萃取剂进行萃取效果对比，二氯甲烷萃取效率高但稳定性差，三氯甲烷萃取效率极高同时较为稳定，故本实验最終选取三氯甲烷做微萃取剂。

2.1.2萃取体积的选择  本实验选取了10、20、30、50 μl三氯甲烷相同条件下萃取样品，萃取剂体积为20 μl和40 μl时，萃取效率偏低，且不稳定;萃取剂量达到50 μl时，萃取效率稳定且达到了分析要求，因此选择三氯甲烷萃取剂的体积为50 μl。

2.2维生素A和维生素E标准曲线分析  本实验条件下，维生素A标准曲线方程为y=13225x+410.03，相关系数为0.9998，检出限为0.042 μg/ml;维生素E标准曲线方程为y=1383.9x-458.27，相关系数为0.9997，检出限为0.096 μg/ml，见图2。

2.3维生素A和维生素E回收率结果  维生素A和E的加标回收率分别为90.12%～103.70%和81.09%～92.21%，见表1。

2.4方法精密度测定  取8份同一血清样品，每份20 μl，按样本处理方法处理后，上机进行测定，计算方法的精密度，结果显示，维生素A RSD为6.23%，维生素E RSD为4.81%。

2.5样本含量测定  按照样品测定方法操作，共测定血清样本50例，维生素A含量范围为（0.62±0.04）μg/ml，维生素E含量范围为（8.41±0.43）μg/ml。

3讨论

血清中维生素的测定是一项较为重要的检测内容，对维生素的测定，不仅能够对日常生活中维生素的补充有指导作用，同时也为很多疾病的诊断提供了依据[3]。目前，关于血清中维生素测定方法主要有液-液萃取、固相萃取、浊点萃取等，定量分析方法主要有高效液相色谱法、质谱法、酶免疫测定法等，然而常规样品的前处理技术通常比较繁琐耗时，需要较多有机溶剂，分析成本大，同时对样品量要求较大，样本前处理时间较长，影响分析的准确性，在微量血清维生素含量测量时难以准确分析。DLPME-HPLC技术是近年来新兴的一种样品处理技术，既保持了萃取溶剂用量小、灵敏度高、环境污染小等特点，又缩短了萃取时间，提高了分析效率[4]。因此该技术在药物分析领域，尤其是生物样品前处理中具有较高的应用价值。

本实验在利用分散液相微萃取技术处理样本时，通过对三氯甲烷和二氯甲烷做微萃取剂进行萃取效果对比，最终选择三氯甲烷作为萃取剂，其主要原因是样本处理过程中因三氯甲烷容易挥发，有利于在低温环境中进行。另外，萃取时，漩涡混匀的力度和时间应尽量保持一致，该步骤对提取效率和精密度有一定的影响。通过对维生素A、维生素E测定的色谱条件的优化，得到了对两种脂溶性维生素测定的最佳色谱条件，由于维生素A最佳吸收波长为325 nm，维生素E最佳吸收波长为290 nm，为达到维生素测定的准确性，应用切换波长程序，波长切换时基线波动较小，对两种维生素测定准确性无影响。同时，色谱柱柱温的高低对测定样本的保留时间、峰宽、峰形上都有一定的影响，且柱温对维生素A和维生素E的影响不同，在流速均为1 ml/min，流动相均为甲醇∶水=98∶2时，柱温达到30～60℃时，维生素A随柱温的升高峰面积逐渐增大，并在60℃时达最大，而维生素E峰面积受柱温的影响不大。由于柱温过高可缩短柱寿命，同时等度洗脱时，温度过高，保留时间太短，不利于样本的分离[5]，因此本实验选择柱温为50℃。最终，本实验按照样品测定方法操作，共测定血清样本50例，维生素A含量范围为（0.62±0.04）μg/ml，维生素E含量范围为（8.41±0.43）μg/ml。因不同人种和人群有较大差异，加上所测样品数量较少，所以本法检测数据不能代表正常人全血中维生素A和E的含量水平，仅供参考。

总之，DLPME-HPLC法操作简便，节约试剂，对样本富集效率高，通过该方法的研究，对微量血清中维生素A和维生素E的测定具很好的的应用价值。

参考文献：

[1]石庆平，王铁华，张浩，等.反相高效液相色谱法检查复方维生素注射液中的有关物质[J].海军医学杂志，2014，5（2）：143-147.

[2]刘信嘉，林森煜，李秀英，等.正相高效液相色谱法同时测定奶粉中维生素A醋酸酯、维生素A棕榈酸酯、维生素E醋酸酯及α-生育酚[J].广东化工，2015，42（5）：126-127.

[3]贾妍，战思恩，翟燕红，等.液相色谱串联质谱法测定血清维生素A、E含量[J].标记免疫分析与临床，2018，25（4）：574-579.

[4]范菲，杨会鸽，周娜，等.HPLC法同时测定多维元素片中维生素A和维生素E的含量[J].西北药学杂志，2016，31（6）：590-592.

[5]张航.离子液体液相微萃取有机紫外线吸收剂的研究[D].云南师范大学，2016.

收稿日期：2019-5-27;修回日期：2019-6-20

编辑/杜帆