博来霉素和内毒素诱导两种品系小鼠肺纤维化模型的比较研究*

何文涓 吴小瑜 袁志坚 黄 寅

(无锡卫生高等职业技术学校，无锡 214028)

特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种原因不明的慢性间质性肺疾病[1-2]。其病理特征主要为弥漫性肺泡炎、成纤维细胞病理性增长和细胞外基质在肺间质及肺泡腔沉积等，造成肺组织结构的破坏，最终导致慢性呼吸衰竭。肺纤维化是肺受损后的一种并发症，其预后极差，5年生存率不到50%，目前对于肺部纤维化类疾病的治疗手段有限，建立稳定而可靠的肺间质纤维化模型是探索其发病机制和开发有效治疗药物的重要保障[3-5]。

目前肺纤维化动物模型采用的主要是啮齿类动物，如小鼠、大鼠、仓鼠等，小鼠具有繁殖快、饲养管理费用低等特点，是科研工作者最常选用的动物[6]。肺纤维化诱导剂主要包括博莱霉素 (Bleomycin, BLM)、内毒素、胺碘酮、百草枯、石棉、二氧化硅、放射线、高浓度氧、野百合碱、呼吸道肠道病毒等，其中以博来霉素和内毒素最为常用[7-9]。本研究以ICR、C57BL/6两个品系小鼠为研究对象，以博来霉素和内毒素为肺纤维化诱导剂，寻找最适合复制肺纤维化模型的小鼠及诱导剂。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级ICR小鼠90只、清洁级C57BL/6小鼠90只，雄性，6～8周龄，体质量18～22 g，浙江省实验动物中心提供，合格证号：SCXK(浙)2017-0001。

1.2 试剂与仪器

博来霉素：海正辉瑞制药有限公司；内毒素：湛江安度斯生物有限公司；羟脯氨酸试剂盒：南京建成生物研究所。

1.3 方法

1.3.1分组:将ICR小鼠随机分为对照组、博来霉素组、内毒素组，每组30只；将C57BL/6小鼠随机分为对照组、博来霉素组、内毒素组，每组30只。

1.3.2小鼠肺纤维化模型建立

博来霉素组：腹腔注射2%戊巴比妥钠(50 mg/kg体质量)，小鼠麻醉后将其固定在30°倾角的鼠板上，在颈部开一个小口暴露气管，用微量进样器插入气管注博来霉素(5 mg/kg)，注射完毕后将小鼠直立左右轻微摇晃10 min，使药液均匀分布于双肺，完毕后缝合皮肤，在伤口处擦碘酒消毒。

内毒素组：内毒素以生理盐水溶解，按40 EU/kg剂量一次性尾静脉注射。

对照组：用与博来霉素同体积的生理盐水气管灌注。

分别于造模后第7、14、28天每组随机处死8只小鼠进行后续试验。

1.4 肺系数测定

将各组小鼠沿腹部剪开，完整分离肺组织，用生理盐水冲洗肺组织3遍，用滤纸吸干后称得肺湿重，计算肺系数，肺系数=肺湿重(g)/体质量(kg)。右肺置于4%甲醛溶液中固定，其余肺组织放于冻存管中，先浸没于液氮1 h，后转移至-80 ℃冰箱中保存。

1.5 小鼠肺组织病理学检查

取右肺组织，用4%甲醛浸泡过夜固定，制备石蜡切片，做HE染色。在光学显微镜下观察肺组织病理学改变。

1.6 ELISA检查肺组织羟脯氨酸

取部分肺组织，称重剪碎后与对应体积的PBS(质量体积比1 g：9mL)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨2 min，5 000×g离心10 min，取上清，用BCA法将不同组上清溶液调至相同蛋白浓度。采用ELISA法检测各组小鼠肺组织中羟脯氨酸(HYP)含量。

1.7 统计方法

2 结果

2.1 两个品系小鼠一般情况

ICR和C57BL/6小鼠中的对照组均状态良好，饮食饮水正常，体质量不同程度增加。相比于对照组，两个品系的博来霉素和内毒素组小鼠在造模后均出现不同程度的体质量减轻，活跃度减少等情况。其中C57BL/6的博来霉素组和内毒素组小鼠体质量下降最显著。ICR博来霉素组小鼠在第7天开始出现死亡，直至第28天共3例死亡；C57BL/6博来霉素组小鼠在第4天开始出现死亡，直至第28天共5例死亡。ICR的内毒素组和C57BL/6的内毒素组小鼠无死亡现象。

2.2 小鼠肺系数

肺系数可以反映单位质量下肺湿重的变化，是反映肺纤维化程度的一个重要指标。两个品系的博来霉素组和内毒素组小鼠的肺系数在第7、14、28天均高于对照组(P<0.05)。其中对于同一种肺纤维化诱导剂，C57BL/6品系的小鼠肺系数在第14、28天与ICR品系小鼠相比，肺系数升高(P<0.05)。对于同一品系小鼠，博来霉素组肺系数与内毒素组相比，无显著性差异(P>0.05)。结果见表1。

表1 两个品系小鼠肺系数的比较Table 1 Comparison of lung coefficient between two strains of

2.3 肺病理形态改变

ICR和C57BL/6的对照组小鼠细支气管和肺泡结构完整，衬附正常纤毛柱状上皮及肺泡上皮，间质仅见少量炎性细胞浸润，毛细血管正常；两个品系的博来霉素组和内毒素组小鼠均出现不同程度的肺纤维化，肺组织支气管和肺泡结构紊乱，间质见较多慢性炎细胞浸润，并可见纤维组织增生。相比于ICR博来霉素组和内毒素组的小鼠，C57BL/6博来霉素组和内毒素组小鼠肺纤维化程度更高，肺组织内炎性细胞浸润、肺泡壁断裂及肺泡腔融合不同程度增加。结果见图1。

2.4 小鼠肺组织中羟脯氨酸含量的比较

ICR和C57BL/6的博来霉素组和内毒素组小鼠肺组织中羟脯氨酸含量在第14、28天均高于对照组(P<0.05)。其中对于同一种肺纤维化诱导剂，C57BL/6品系的小鼠肺组织中羟脯氨酸含量在第7、14、28天与ICR品系小鼠相比，含量升高(P<0.05)。对于同一品系小鼠，博来霉素组小鼠的肺组织中羟脯氨酸含量与内毒素组小鼠相比，无显著性差异(P>0.05)。结果见图2。

图2 两个品系小鼠肺组织HYP含量注：两个品系分别于对应的对照组小鼠比较，*P<0.05；与另一品系对应的相同组别小鼠比较，#P<0.05Fig.2 HYP content in lung tissue of two strains of Note：The two strains were compared in the corresponding control mice, *P<0.05; compared with the same group of mice corresponding to another strain,#P<0.05

3 讨论

博来霉素是从轮状链霉菌(Streptomycesverticillatus)中分离出来的，可有效对抗鳞状细胞癌和皮肤肿瘤，然而其抗肿瘤作用具有引起肺纤维化的副作用[10]。博来霉素诱导的动物肺纤维化模型与人类肺纤维化过程相似度较高，是国内外常用的肺纤维化诱导剂，常用的方法是通过气管给药[11]。

内毒素是革兰阴性菌细胞壁成分，其化学性质为脂多糖(LPS)，耐热而稳定，不易被破坏，在动物体内可引起发热反应、白细胞反应甚至内毒素性休克，是临床上引起急性肺损伤的重要因素[12-13]。国内外已有一些学者采用内毒素制备急性肺损伤肺纤维化模型，可通过气道、腹腔及静脉等多种途径给药[8,14]。

C57BL/6是一种常用的近交品系实验鼠，群体反应性比较均一。C57BL/6 小鼠肺组织的组织学结构接近于人类，其作为肺纤维化的模型能够模拟人的肺纤维化的发病机制和过程[15-16]。ICR小鼠是一类繁殖力、抗病力和适应力均很强的远交群小鼠，被广泛应用于药理学、毒理学等多种领域的研究[17]。

本研究显示在造模后的第14、28天，C57BL/6的博来霉素组和内毒素组均出现不同程度的肺纤维化，其中对于同一种肺纤维化诱导剂，C57BL/6品系小鼠的肺纤维化程度与ICR品系小鼠相比，有显著差异。对于同一品系小鼠，博来霉素组的肺纤维化程度与内毒素组相比，无显著差异。实验结果表明，C57BL/6小鼠较ICR小鼠更适合复制博来霉素和内毒素诱导的肺纤维化动物模型，但这两种肺纤维化动物模型形成机制的差异性及适用条件需要进一步研究。