小鼠巨细胞病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用*

李晓波 付 瑞 王 吉 王淑菁 王莎莎 李 威 秦 骁 黄宗文 贺争鸣 岳秉飞

(中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京 102629)

小鼠巨细胞病毒(Mouse Cytomegalovirus, MCMV)分类上属疱疹病毒科，乙型疱疹病毒亚科，具有严格的种属特异性，野生小鼠是该病毒的主要来源，主要通过动物亲密接触传播，也可经胎盘垂直传播[1]。

自然感染小鼠多呈亚临床过程，但病毒会潜伏在免疫功能健全动物体内[2]，胎鼠或免疫缺陷动物感染会发生严重疾病[3]，如会改变小鼠呼吸系统、血液系统内环境的平衡，从而对细菌和病毒更加易感，更重要的是会抑制动物的免疫应答，抑制抗体产生及Tc细胞的功能[4]。欧洲实验动物联合会(FELASA)、Charles river实验室及Harlan实验室等均已将MCMV列为实验小鼠日常监测项目[5]，早在八九十年代就有学者建议将MCMV作为SPF动物应排除的病原体[6]，目前我国的实验动物国家标准对MCMV的检测没有规定。本研究建立的MCMV特异的TaqMan探针实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法，具有高灵敏度和特异性的特点，为实验小鼠MCMV日常监测及动物源性生物制品中MCMV的检测提供了技术参考。

1 材料与方法

1.1 试剂

FQ-PCR引物探针由ABI公司合成，TaqMan Universal PCR Master Mix为ABI产品；病毒核酸提取试剂盒购自Takara公司。

1.2 病毒株和样品

小鼠巨细胞病毒(MCMV)smith株(103.75 TCID50/0.1 mL)，大鼠巨细胞病毒(RCMV)购自ATCC，编号VR-991；猴巨细胞病毒(SCMV)、人单纯疱疹病毒sm44株(HSV)、伪狂犬病毒(PRV)及猫疱疹病毒I型(FHV-1)均为本室保存；2018年14家单位送检的SPF级小鼠抗凝血样品307份，清洁级小鼠抗凝血102份，具体见表1。

表1 临床样本信息Table 1 Clinical samples information

1.3 方法

1.3.1引物设计：选择小鼠巨细胞病毒Smith株(Genbank：KY348373)DNA polymerase基因保守序列设计引物和探针，序列见表2。

表2 MCMV FQ-PCR引物探针信息Table 2 Primers and probes for MCMV FQ-PCR

1.3.2病毒核酸的提取：小鼠巨细胞病毒、大鼠巨细胞病毒、猴巨细胞病毒、人单纯疱疹病毒sm44株、伪狂犬病毒及猫疱疹病毒I型，各取0.2 mL病毒液按试剂盒说明提取DNA，最后用150 μL灭菌水洗脱。

1.3.3质粒标准品的制备：由擎科生物合成MCMV(Genbank：KY348373)80691～80880 bp的DNA序列，转入pClone007 Blunt Vector载体，构建质粒标准品pClone007-MCMVp，经测定其浓度为4.7×1010copies/μL。

1.3.4MCMV FQ-PCR扩增体系及标准曲线的建立：对引物、探针浓度、退火温度等条件进行优化，优化后的反应体系为：TaqMan Universal PCR Master Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，探针(10 μmol/L)0.2 μL，DNA模板1 μL，灭菌ddH2O补足至终体积20 μL。反应程序为：50 ℃ 2min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1min，40个循环。将质粒标准品pClone007-MCMVp 10倍系列稀释为109～100copies/μL，以其为模板，按上述反应体系和反应条件进行PCR扩增，每个稀释度做3 个平行，选取线性较好的7 个稀释度绘制标准曲线。

1.3.5MCMV FQ-PCR方法的敏感性验证：

1.3.5.1 以4.7×109～4.7×100copies/μL系列稀释的质粒标准品为模板，用优化好的反应条件进行检测，每个稀释度做3个平行，验证方法的敏感性。

1.3.5.2 与其他PCR方法敏感性比较：将步骤1.3.2提取的MCMV核酸10-1至10-8系列稀释，使用本方法、文献报道的常规PCR法、FQ-PCR方法分别检测[7]，比较各方法的灵敏性。

1.3.6MCMV FQ-PCR方法特异性验证：用建立的荧光定量PCR法检测小鼠巨细胞病毒，大鼠巨细胞病毒，猴巨细胞病毒，人单纯疱疹病毒，伪狂犬病毒及猫疱疹病毒I型等疱疹病毒科病毒的核酸，验证方法的特异性。

1.3.7MCMV FQ-PCR方法的重复性和稳定性验证：应用优化好的的反应条件，以不同浓度的质粒标准品(4.7×106，4.7×104和4.7×102copies/μL)为模板进行FQ-PCR扩增，每个浓度设置3个重复，同时选择不同的3个时间点检测，计算组内和组间Ct值均值，标准差及变异系数。

1.3.8MCMV FQ-PCR方法的应用

1.3.8.1 模拟感染样本的检测：MCMV病毒液(103.75 TCID50/0.1 mL)分别按10-1～10-8的比例掺入MCMV阴性小鼠抗凝血，模拟病毒感染样品，每个稀释度做3个平行，各取200 μL，按DNA提取试剂盒说明提取核酸，用MCMV FQ-PCR方法进行检测。

1.3.8.2 临床样本的检测：应用建立的MCMV FQ-PCR方法检测2018年14个实验动物生产和使用单位送检的小鼠抗凝血样品，包括SPF级小鼠血清307份，清洁级小鼠102份(表1)。

2 结果

2.1 MCMV荧光定量PCR扩增体系及标准曲线的建立

用优化好的体系扩增108～102copies/μL的标准质粒，各稀释度扩增曲线间距均匀，标准曲线Slope为-3.418(在-3～-3.5之间)，R2值为0.999(>0.99)，扩增效率为96.137%(90%～105%之间)(图1、2)。

图1 MCMV荧光定量PCR标准曲线Fig.1 MCMV FQ-PCR standard curve

图2 MCMV荧光定量PCR方法扩增曲线Fig.2 MCMV FQ-PCR amplification curve

2.2 MCMV FQ-PCR方法的敏感性验证

如图3所示，4.7×109～4.7×101copies/μL各稀释度的质粒标准品均出现S型扩增曲线，而4.7×100copies/μL的3个平行实验有1个未出现S型扩增曲线，说明本方法最低可定量检测到47copies/μL的样品。用MCMV FQ-PCR方法和常规PCR方法检测同样的10-1至10-8系列稀释的MCMV核酸样品，由图4可见，MCMV FQ-PCR方法最低可检测到10-4稀释度的MCMV核酸，常规PCR最低可检测到10-2稀释度，表明MCMV FQ-PCR方法敏感性比常规PCR方法高两个数量级；用建立的MCMV FQ-PCR方法与文献报道的FQ-PCR方法检测相同的10-1至10-8系列稀释的MCMV核酸样品，每个稀释度做3个平行，两种方法检测到的最大稀释度均为10-4，但本方法每个稀释度的Ct值均值均低于文献方法(表3)，说明本方法的敏感性高于文献方法。

图3 MCMV荧光定量PCR方法敏感性验证扩增曲线Fig.3 MCMV FQ-PCR sensitivity test amplification curve

图4 MCMV荧光定量PCR方法(A)与常规PCR方法(B)敏感性比较注：M:100 bp DNA Marker；1～8：10-1至10-8系列稀释的MCMV核酸；9：阴性对照Fig.4 Comparison of sensitivity between MCMV FQ-PCR (A) and conventional PCR (B)Note: M: 100 bp DNA Marker；1-8：10-1 to 10-8 serially diluted MCMV nucleic acids; 9：Negative control

表3 两种荧光定量PCR方法敏感性比较Table 3 Comparison of sensitivity between two fluorescence quantitative PCR methods

2.3 方法的特异性验证

图5显示，当以MCMV为模板时，出现FAM荧光扩增曲线(Ct值为26，对应浓度为7.71×104copies/μL)，以大鼠巨细胞病毒，猴巨细胞病毒，人单纯疱疹病毒，伪狂犬病毒及猫疱疹病毒I型为模板均无明显扩增曲线。表明所建立的荧光定量PCR法特异性强，与其他病毒均无交叉反应。

图5 MCMV荧光定量PCR方法特异性验证扩增曲线注：1～7分别为MCMV、RCMV、SCMV、HSV、PRV、FHV-1、阴性对照Fig.5 MCMV FQ-PCR specificity test amplification curveNote: 1-7: MCMV、RCMV、SCMV、HSV、PRV、FHV-1 and negative control

2.4 MCMV FQ-PCR方法的重复性和稳定性验证

用建立的FQ-PCR方法检测4.7×106，4.7×104和4.7×102copies/μL三个浓度的质粒标准品，由表4可见其组内变异系数为0.39%～0.68%，组间变异系数为0.48%～1.01%，方法的重复稳定性良好。

2.5 MCMV FQ-PCR方法的应用

用建立的MCMV FQ-PCR方法检测掺入MCMV(103.75 TCID50/0.1 mL)病毒的小鼠抗凝血样品，10-1～10-3稀释度3个平行均为阳性，其Ct值均值分别为30.566、33.012、36.337，10-4稀释度有2个平行出现扩增曲线，1个平行未出现，10-5～10-8稀释度均为阴性，表明本方法可检测到小鼠抗凝血样品中MCMV的最大稀释度为1∶1000，对应病毒毒力为100.75 TCID50/0.1 mL(图6)。检测2018年送检的307份SPF小鼠及102份清洁级小鼠抗凝血样品，结果均为阴性。

3 讨论

荧光定量PCR方法灵敏度高，耗时少，特异性强，目前已广泛用于病原体的检测[8-9]，本研究选取小鼠巨细胞病毒DNA polymerase基因保守序列设计引物和探针，建立了MCMV FQ-PCR检测方法，各稀释度扩增曲线间距均匀，以标准质粒建立标准曲线，Slope为-3.418，相关系数R2值为0.999，扩增效率为96.14%，说明本FQ-PCR方法可实现对MCMV的有效定量。MCMV FQ-PCR在以大鼠巨细胞病毒、猴巨细胞病毒等同类病毒及人单纯疱疹病毒、伪狂犬病毒、猫疱疹病毒I型(FHV-1)等同科病毒为模板时均无扩增，说明方法的特异性良好；敏感性方面最低可检测到47copies/μL的MCMV，比常规PCR方法的敏感性高两个数量级，与已有的FQ-PCR法[7]相比各浓度的Ct值均低于后者，说明本方法的敏感性更高。选取各相差两个数量级的3个浓度的标准质粒做方法的重复性及稳定性验证，组内变异系数小于1.0%，组间变异系数小于1.5%，表明本方法有很好的重复性和稳定性。

MCMV感染小鼠后可分布在血液、唾液腺、肝、脾、肺等组织中[7，10]，本研究选取小鼠EDTA抗凝血作为检测样品，根据动物福利的“3R”原则，对方法进行应用时本研究未进行动物感染实验，而是检测了模拟感染样品，即将MCMV按10倍系列稀释掺入小鼠抗凝血样品进行检测，结果10-1～10-3每个稀释度的3个平行实验均为阳性，说明本方法可有效检测到动物血液样品中的MCMV。不同品系小鼠对MCMV的易感性不同，其中BALB/c小鼠对MCMV较易感，而C56BL/6小鼠对MCMV有较强抵抗力[11-13]，研究人员对2018年北京地区14家单位送检的409份小鼠血液样品进行检测，其中BALB/c小鼠占大多数，既有SPF级也有清洁级，结果均为阴性，表明现阶段北京地区实验小鼠中MCMV的控制情况良好，与前几年报道的14.94%的感染率相比大幅下降[9]，原因可能在于实验小鼠于2001年取消了普通级后，最低等级变为清洁级，要求在屏障环境中饲养，管理水平也相应提高，杜绝了与野生鼠接触的机会，因而感染率得到了有效控制。

鉴于MCMV传播特点及对动物尤其是胎鼠的危害，且目前并未纳入实验动物国家标准，因而在实验小鼠种群中仍存在爆发流行的风险，对MCMV的日常监控不容忽视。本研究建立的MCMV荧光定量PCR方法特异性、重复性和稳定性好，并且有更高的检测灵敏度，适用于实验小鼠及鼠源性制品中MCMV的监测，同时可为实验动物相关标准的制定和补充提供技术参考。