长期精神紧张建立抑郁症模型*

龚 宇 徐腾鹤 钱婷婷 罗 颖 陈 浩 赵丽君 吴晓光

(1.承德医学院,承德 067000)(2.承德医学院基础医学研究所，承德 067000)

近年来抑郁症的发病率逐年增高。据世界卫生组织最新统计，抑郁症影响到全球约20%的人群，预计到2020 年，抑郁症将在医疗疾患排名中居第2位[1]。抑郁症的发病机制十分复杂，目前的研究未能完全阐明疾病的病因，为特效药物研发和临床治疗造成了极大的难度[2]。抑郁症动物模型制作若能相对简单方便、成熟稳定，对于研究其致病机制和开发抗抑郁药物具有重要的作用。目前关于抑郁症动物模型有许多种，如习得性无助、慢性不可预见性刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)、母婴分离、社会挫败等[3]，多采用长期不可预见、轻度的应激以模拟人在生活中经历的负性生活事件进行造模。许多临床调查表明[4]，长期经历负性事件是导致抑郁症的主要危险因素之一。现代人们在面对着逐步加快的生活节奏和日趋激烈的社会竞争时，长期的精神高度紧张成为常态，而这可能是抑郁症发病的重要原因之一。本模型采用长期惊吓和睡眠剥夺使小鼠长期处于精神紧张状态，造模后进行抑郁行为学测试，探究长期精神紧张与抑郁症的关系，为开展有关抑郁症的发病机制及药物研发提供动物模型基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

C57BL/6 J雄鼠小鼠(4周龄)17只，SPF级，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号: SCXK(京)2014-0004。饲养于清洁级环境，实验期间所有小鼠均可以自由饮水、摄食，明暗周期为12 h/12 h(8: 00—20: 00)，室温21～23 ℃，湿度50%～55%。适应性饲养1周。

1.2 仪器

小动物运动轨迹跟踪系统(购自上海欣软信息科技有限公司)。旷场行为测试箱，自制(长×宽×高为50 cm×50 cm×30 cm)。睡眠剥夺箱，自制(长×宽×高为60 cm×40 cm×30 cm)，中央固定一直径30 mm平台。

1.3 模型建立

将17只雄性小鼠随机分为对照组7只、长期精神紧张刺激(LTMS)组10只。LTMS组单笼饲养。对照组7只一笼饲养，正常饲养，每周测定摄食量，刺激实验之后进行行为学实验。对LTMS组小鼠采用每天随机时间进行猫惊吓3 h、睡眠剥夺12 h两种刺激，连续21 d。睡眠剥夺箱使用60 cm×40 cm×30 cm水箱，水面深度足够淹没小鼠，在中央放置直径30 mm圆台并高出水面0.5 cm，在水箱上方放置有鼠粮的铁网，以确保小鼠的食物供给。猫吓操作在直径1.2米的旷场中，将装有单只小鼠的铁笼放在中央，吸引猫对小鼠惊吓，为确保猫在长期实验中的兴趣，实验前禁食并不定期给予活鼠奖励。

1.4 行为学评价

1.4.1摄食量测定：参考汤球等[5]操作方法，分别于刺激的第0天、第7天、第14天、第21天早上8:00给小鼠添加食物50 g，次日早上8:00称取每只小鼠的食物残余量，计算其24 h摄食量。同时对小鼠称质量，以24 h内消耗食物量(mg)/体质量(g)作为食物消耗量。同笼的小鼠要分开孤笼测量。

1.4.2旷场实验：用旷场实验(open field test,OFT)检测小鼠活动度和对陌生环境探索的行为程度，水平和垂直运动的次数是旷场实验主要观察指标[6]。刺激造模21 d之后在安静、适宜小鼠的环境中，将小鼠放置于旷场敞箱(50 cm×50 cm×30 cm)底面中心，箱壁四周及底面为白色。底面划分为9个等边方格。旷场观察实验时间为5 min。将小鼠放入中心方格内，摄像记录5 min内穿越格数(以重心越过为准)，记录小鼠在旷场中的运动路程、穿越格数(水平活动得分)和前肢均离地或攀壁的直立次数(垂直活动得分)。每次实验后用75%酒精对旷场装置进行清理，消除异味。

1.4.3高架十字迷宫实验：高架十字迷宫由开放臂(30 cm×5 cm)、闭合臂(30 cm×5 cm×15 cm)和两臂汇合的中央区(5 cm×5 cm)组成，距地面50 cm。根据实验[7]，于模型刺激21 d测试，将小鼠放在中央区，面对开臂方向，观察动物在开臂和闭臂中的活动情况[8]，实验在暗光、安静下进行，观察5 min，记录小鼠进入开放臂次数、开放臂停留时间、进入闭合臂次数和闭合臂停留时间。

1.4.4强迫游泳实验：强迫游泳实验主要记录小鼠在水中放弃挣扎不动的时间，可以较好反映其低落情绪和绝望状态[6]。参考Porsolt等[9]的操作方法并根据具体条件稍作修改，于模型刺激21 d测试，实验前为减少小鼠紧张感，提前1 h将小鼠移至安静的实验室。实验时将小鼠置于直径15 cm的上方开口的透明圆柱形容器之中，水深15 cm，水温(23±2)℃，持续6 min，全程通过摄像机记录，统计后5 min内小鼠不动的总时间。每只小鼠实验后换水并清洗侧壁以防止残留气味影响实验。小鼠在水中确保头部浮起并停止挣扎或偶尔滑动并保持漂浮判断为不动状态[10]。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 摄食量变化

结果见表1。与对照组相比，第1周摄食量上升，无显著性差异(P>0.05)。第14天摄食量下降,无显著性差异(P>0.05)，第21天摄食量明显下降，差异具有极显著性(P<0.01)。

表1 两组小鼠食物消耗量Table 1 Two groups of mice food

2.2 行为学各项指标变化

见表2。与对照组相比，LTMS组强迫游泳实验中不动时间明显延长，差异具有极显著性(P<0.01)。旷场试验中，LTMS组小鼠穿越格数和直立次数均明显少于对照组，差异具有极显著性(P<0.01)。高架十字迷宫实验中，LTMS组小鼠闭合臂停留时间明显延长，差异具有极显著性(P<0.01)，开臂进入次数占比次数减少，差异具有显著性(P<0.05)。

表2 两组小鼠行为学指标比较Table 2 two groups of mice behavior index

3 讨论

抑郁症是一类以思维迟缓、情绪低落、主动性下降和兴趣减低等精神运动性迟滞症状为主要表现的心境障碍综合征[11]。一个符合临床表现且稳定的抑郁症模型是研究致病机制和抗抑郁药物的重要前提，目前建模的方法很多，如应激模型、损伤模型、化学药物诱导和基因型改变等。以慢性不可预见性刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)最常用[12]，但是通过CUMS最后所得的抑郁症动物模型实际操作过程的工作量较大，难以复制。动物模型的衡量标准为表面效度、结构效度和预测效度，表面效度指模型具有相似的临床表现，结构效度则是具有相应的病理生理学的改变，而模型的疾病表现可被有效的药物逆转为预测效度[13]。本研究通过研究长期精神紧张刺激建立模型，通过模拟长期精神打击来提高实验结果的可信度。参照孙秀萍等[14]提出的旷场试验、强迫游泳和高架十字迷宫等抑郁行为实验方法，观察动物模型在长期应激作用时是否出现快感缺失、行为绝望和获得性无助等情绪表现。从而判断长期恐惧所造成的精神紧张在抑郁症发病中的作用。

本实验通过利用小鼠对于猫的恐惧结合睡眠剥夺刺激造模，模拟出抑郁症患者长期精神紧张表现。猫作为小鼠的天敌，在恐吓实验中会造成鼠神经行为学功能退化、单胺类神经递质含量下降等表现[15]。高江晖等[16]报道，C57BL/6小鼠在睡眠干扰环境中会产生类抑郁样行为学改变，且随干扰时间延长，抑郁症表现程度也相应加重。姚丽华等[17]研究认为在抑郁模型中孤养比群居更具有长期稳定性，本研究结合猫吓鼠、剥夺睡眠和孤养造模，相对于慢性不可预见性刺激模型的造模时间长、劳动量大、结果不稳定和难以重复的缺点[18]，具有造模方法简单、易操作的优点，同时又模拟了更贴切实际的精神紧张刺激来提高模型可信度。

本实验造模前期，小鼠易激惹、焦躁，反抗性强，造模后期精神萎靡，被毛杂乱无光泽，反应迟钝。对比对照组，LTMS组小鼠应激前摄食量差异无显著性，在第7天摄食量增加，除了与小鼠处于快速生长期有关，前期的精神紧张刺激可能加剧了小鼠摄食量，LTMS组小鼠在第14天之后摄食量减少，在第21天摄食量明显减少并有显著性差异。同时小鼠体质量增长也缓慢，提示长期的猫吓和睡眠剥夺影响了小鼠进食欲望，并导致其生长迟缓。第28天时，模型组小鼠被毛暗淡，活动性差且外物刺激时反应迟钝。造模期间3只小鼠死于刺激，死亡率为30%。强迫游泳实验中将小鼠放在盛水的圆柱容器内，最初在水中表现出剧烈挣扎并试图逃脱，但当发现无法逃脱时便停止挣扎，头部露出水面保持一种在水中漂浮不动的状态，此状态称为“行为绝望”[15]。本实验中，LTMS组小鼠不动时间显著性延长，表现出了行为绝望状态。旷场试验中，小鼠穿越水平格数和站立次数可以反映活动度和探究行为[19]。LTMS组小鼠穿越格子数(水平运动)和直立次数(垂直运动)较对照组明显减少，反映了小鼠的活动度降低和对新鲜环境的探索欲望降低。高架十字迷宫实验中，小鼠在与外界环境相通的开臂中会有一定的新奇性和探索欲望，小鼠由于嗜暗性会倾向于在闭臂中活动，但出于好奇心和探究性又会在开臂中活动[20]。焦虑抑郁水平高的小鼠会退缩到闭臂中，反之对开臂的探究次数则增多[21]。本研究结果显示，LTMS组小鼠进入开臂的次数比例显著下降，且在闭臂时间显著增加，提示产生焦虑行为。

综上所述，长期精神紧张刺激模型表现出的行为绝望、活动能力下降、兴趣丧失和焦虑与抑郁症临床表现相似，且结合孤养模拟了抑郁症发病的常见因素，成功地建立了符合表面效度的小鼠抑郁模型。