HPLC-FLD方法检测早孕期大鼠胚胎的苯并芘水平

梁婧，侯海燕，王梦，孙旸，陈亚琼

苯并（a）芘[benzo（a）pyrene，BaP]是多环芳烃类环境污染物中典型的一种，以其强致癌性、致畸性、致突变作用而广受关注，美国环保局将16种母体多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）列为优先控制污染物，我国则将Bap列为优先控制污染物[1]。BaP可透过胎盘屏障，对早孕期大鼠产生胚胎毒性，与胚胎发育异常、胚胎组织过度凋亡、DNA损伤及氧化损伤等不良妊娠结局有关[2-4]。目前对BaP的检测多集中于动物及人体肺脏、肝脏等组织器官，或肉、海鲜等食物样品，而以动物胚胎组织为样本的检测及研究报道较少。实验中常用于检测样品中BaP的方法有：高效液相色谱-荧光检测器法（HPLCFLD）[5-6]、气相色谱-质谱法[7-8]、凝胶渗透色谱-高效液相色谱法[9-10]、紫外分光光度法[11]。HPLC-FLD简便、快速，准确度高，是应用最为广泛的检测方法，其中凝胶渗透色谱-高效液相色谱法常用于检测食用油中BaP的含量，是采用凝胶渗透色谱净化样品，这种方法样品净化效果好，但实验过程耗时较长。气相色谱-质谱法常用于测定样品中多种多环芳烃，在最佳条件下，各物质之间能够良好地完全分离分析。本实验拟使用HPLC-FLD测定给药大鼠早孕胚胎组织中BaP的浓度，以期更直观地检测给药大鼠胚胎中BaP的含量，为今后环境污染物的生殖毒性评估提供更有效、全面、直观的途径和实验方法。

1 材料与方法

1.1 实验仪器 日本岛津高效液相色谱仪，包括：SCL-6B色谱系统控制器，LC-6A恒流泵，RF-535荧光检测器；分析软件为Anastar色谱工作站；色谱分析柱为Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μL，天津色谱科学技术公司）；PB153-S型电子分析天平；TG16A-WS型台式高速离心机（湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司）；C9860A超声波清洗仪（CBL光电子技术有限公司）；YKH-I型漩涡混合器（江西医疗器械厂）；HGC-12A型氮吹仪（天津恒奥科技发展有限公司）。

1.2 实验试剂 BaP标准品（纯度不低于95.0%；东京化成工业株式会社；批号：21GMD-G）；乙腈（色谱纯；含量不低于99.9%；天津市康科德科技有限公司；批号：130108）；甲醇（色谱纯；含量不低于99.9%；天津市康科德科技有限公司；批号：140106）；实验用水为超纯水；其他实验试剂均为分析纯。

1.3 样品来源 将30只雌性SD大鼠随机分为2组：BaP模型组和空白对照组，每组15只。BaP模型组雌鼠每日以BaP溶液2 mg/（kg·d）灌胃，空白对照组予相同体积的生理盐水。15 d后停止给药，雌雄鼠合笼，制备孕鼠模型，孕期9 d后用颈椎脱臼法处死孕鼠并称取孕鼠早孕胚胎组织，得到实验所用的生物样品，从各组中随机选取4份样本并标记，BaP模型组（B6、B8、B9、B10），空白对照组（K1、K2、K3、K6）。本实验过程中将样品置于-18 ℃冰箱中贮存。

1.4 色谱条件 使用色谱分析柱Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μL）；柱温为室温；荧光检测器参数设定：激发波长（Ex）为364 nm，发射波长（Em）为427 nm，检测敏感度为4；流动相为甲醇/水（95∶5，V/V）；流速为1.0 mL/min；进样量为20 μL。

1.5 标准品溶液的配制

1.5.1 标准品储备液的配制准确称取BaP标准品10 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，充分摇匀后放入超声清洗仪中超声15 min，即得浓度为1 mg/mL的BaP标准品母液，避光，放置4 ℃冰箱中贮存。

1.5.2 标准品供试液的配制精密吸取浓度为1 mg/mL的BaP标准品母液100 μL，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，充分摇匀即得浓度为1 μg/mL的BaP标准品贮备液，避光，放置4 ℃冰箱中贮存。

1.5.3 系列浓度的标准溶液的配制精密吸取适当体积标准品供试液适量，置于离心管中，再加入相应体积的适量甲醇，用涡旋混合器混合均匀，即可得系列浓度为0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.5 μg/mL的标准品溶液，且每次使用前应重新配制，实验过程中避光放置，以尽可能减少待测物质的分解。

1.6 生物样品的前处理 取给药大鼠早孕胚胎组织，使用分析天平精密称重，转移至离心管中，将胚胎组织捣碎至匀浆状态，加入200 μL超纯水，用漩涡混合器混合均匀，再加入200 μL色谱纯乙腈，用漩涡混合器混合10 min，10 000 r/min离心10 min，将上清提取液全部吸出至另一离心管中，剩余组织重复以上步骤进行再一次提取，将2次上清提取液合并，用氮吹仪于45 ℃温度下吹干，吹干后加入200 μL流动相溶解，用漩涡混合器混合均匀，10 000 r/min离心10 min，取上清液进样20 μL，供高效液相色谱仪检测。

1.7 线性关系考察 取标准储备母液以甲醇进行逐步稀释配制成0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.5 μg/mL一系列的标准溶液。参照1.6的步骤操作，以标准溶液浓度为横坐标，以测得的峰面积为纵坐标作图，进行线性回归并计算相关系数。

1.8 精密度实验 取BaP浓度为0.005 μg/mL、0.02 μg/mL、0.1 μg/mL的标准品溶液，按照1.4所述的色谱条件下，在同一天内每个浓度各重复进样5次，每次进样均按照浓度从低到高的顺序，得到平均峰面积，计算日内精密度；在连续3天的同一时段（10时至12时）内各进样一次，得到平均峰面积，计算日间精密度。

1.9 样品测定及回收率实验 按照1.6所述的样品处理方法，分别加入浓度为0.005 μg/mL、0.02 μg/mL、0.1 μg/mL的标准品溶液300 μL，每个浓度重复进样5次，结果取5次峰面积的平均值。将测得的空白组样品平均峰面积带入提取标准曲线；在1.4所述色谱条件下，进行样品测定。

1.10 统计学方法 采用标准物质的保留时间对样品峰进行准确定性，采用外标法以峰面积计算定量，依次配制不同浓度的BaP标准溶液进样分析，以标准品溶液浓度（μg/mL）为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

2 结果

2.1 色谱行为及专属性 在色谱条件下检测，比较BaP标准品溶液和生物样品的色谱图样可以看出，无论标准品溶液还是给药大鼠早孕胚胎组织中的BaP峰型均对称性良好，无拖尾现象；给药大鼠早孕胚胎组织中含有2种内源性杂质干扰峰，但干扰峰的保留时间与BaP色谱峰的保留时间相差甚远，不影响定量检测，整个色谱分析过程可以在20 min内完成。见图1、图2。

图1 BaP标准品溶液的色谱图

图2 给药大鼠早孕胚胎组织中BaP的色谱图

2.2 标准曲线

2.2.1 提取标准曲线回归方程为=426 174x－316.95，相关系数r=0.999 9。结果表明在样品基质中的BaP标准品溶液在0.002～0.5 μg/mL的浓度范围内线性关系良好。见表1、图3。

表1 BaP提取标准曲线测定数据

图3 BaP标准品溶液的提取标准曲线

2.2.2 方法标准曲线回归方程为Y=464 629x－192.75，相关系数r=0.999 9。结果表明BaP标准品溶液在0.002～0.5 μg/mL的浓度范围内线性关系良好。见表2、图4。

表2 BaP方法标准曲线测定数据

图4 BaP标准品溶液的方法标准曲线

2.3 回收率实验

2.3.1 提取回收率将测得的空白组样品平均峰面积带入提取标准曲线回归方程为=426 174x－316.95中，将测量值与实际加入量值进行比较，计算所得此方法的BaP提取回收率均大于95%，相应的相对标准偏差（RSD）值为1.24%。见表3。

表3 BaP的提取回收率 （±s，n=5）

表3 BaP的提取回收率 （±s，n=5）

回收率（%）添加量（μg/mL）平均回收率（%）实测量（μg/mL）RSD（%）0.005 0.004 981 99.63 95.88±6.13 1.24 0.005 0.004 338 86.77 0.005 0.005 151 102.16 0.005 0.004 902 98.03 0.005 0.004 641 92.82 0.02 0.019 689 98.45 97.79±1.51 0.02 0.019 590 97.95 0.02 0.019 968 99.84 0.02 0.019 346 96.73 0.02 0.019 196 95.98 0.1 0.102 972 102.97 98.11±3.35 0.1 0.094 668 94.67 0.1 0.096 942 96.94 0.1 0.095 965 95.97 0.1 0.100 006 100.01

2.3.2 方法回收率使用上文2.3.1所得的检测结果，将测定结果带入方法标准曲线的回归方程Y=464 629x－192.75中，比较测得量与实际加入量，计算所得此方法的BaP提取回收率均大于82%，相应的RSD值为4.35%。见表4。

表4 BaP的方法回收率 （±s，n=5）

表4 BaP的方法回收率 （±s，n=5）

添加量（μg/mL）RSD（%）0.005 0.004 302 86.04 82.60±5.63 4.35 0.005 0.003 712 74.24 0.005 0.004 418 88.36 0.005 0.004 229 84.57 0.005 0.003 99 79.79 0.02 0.017 792 88.96 88.36±1.38 0.02 0.017 702 88.51 0.02 0.018 048 90.24 0.02 0.017 478 87.39 0.02 0.017 340 86.70 0.1 0.094 176 94.18 89.72±3.08 0.1 0.086 559 86.56 0.1 0.088 644 88.64 0.1 0.087 749 87.75 0.1 0.091 455 91.46实测量（μg/mL）回收率（%）平均回收率（%）

2.4 精密度实验

2.4.1 日内精密度RSD在3.14%～3.69%之间，平均RSD为3.38%，表明该方法日内精密度良好。见表5。

表5 BaP的日内精密度 （n=5）

2.4.2 日间精密度 RSD在2.29%～3.49%之间，平均RSD为2.80%，表明该方法日间精密度良好。见表6。

表6 BaP的日间精密度 （n=5）

2.5 稳定性实验 取苯并芘浓度为0.1 μg/mL的标准品溶液，按照上文1.4所述色谱条件下，连续重复进样6次，得到平均峰面积8 319.67±214.60，计算RSD为2.58%，表明该方法稳定性良好。

2.6 样品测定 按照上文1.6所述的样品前处理方法，处理给药大鼠早孕胚胎组织，在1.4所述的色谱条件下，对给药大鼠早孕胚胎组织中的BaP浓度进行检测，每个样品进样2次，以保证所得数据的准确度，取平均峰面积进行浓度换算，最终得出BaP模型组大鼠胚胎中BaP平均浓度含量为0.263 354 25 μg/g。见表7。

表7 给药大鼠早孕胚胎组织中苯并芘的浓度 （n=2）

3 讨论

BaP作为多环芳烃类环境污染物中典型的一种，引起国内外学者的持续关注，但涉及生殖系统毒性的研究还未广泛开展，直观检测染毒动物生殖器官样本中BaP含量的研究更是少见。因此，本研究试图逐步探索一种可用于检测动物生殖器官组织中环境污染物的检测手段和方法。近年来，液相色谱-串联质谱法作为一种新兴技术，同样被应用于检测样品中BaP的含量，国内学者曾采用液相色谱-串联质谱法检测食用油脂中的BaP[12]，此方法的检测限为0.1 ng/mL，平均回收率范围为89.9%～102%，样品处理方法十分简单，检测结果准确，可见此种方法尤其适合用于检测样品中BaP含量极低的实验。通过借鉴、改良和优化实验条件，本研究使用HPLC-FLD测定给药大鼠早孕胚胎组织中BaP的浓度，建立HPLCFLD测定生物样品中BaP，实验结果均满足给药生物样品检测的要求。利用所建立的方法对给药大鼠早孕胚胎组织中BaP的浓度进行了分析测定，样品中检测出的浓度在0～0.583 7 μg/g之间。BaP模型组大鼠胚胎中BaP平均浓度含量为0.263 354 25 μg/g。孕鼠胚胎中检测到BaP，再次印证了BaP可以透过胎盘屏障产生胚胎毒性。本实验建立的HPLC-FLD直观检测动物生殖器官样本中微量环境污染物的方法，亦可用来监测和评估环境与职业暴露危害、辅助职业病的早期诊断以及生殖毒性的测定，具有一定创新性。但本研究仅以大鼠胚胎及胎盘为研究对象，尚未对大鼠外周血、肝、肾等其他重要脏器及组织残留BaP进行检测，有待后续进行更为深入的实验，全面对BaP的毒性进行评估。

此外，目前国内外检测样本中BaP的常用提取法主要有：咖啡因络合物提取、液-液萃取。咖啡因络合物[13]提取过程所用试剂种类较多，步骤复杂；液-液萃取中常采用苯、环己烷、乙腈、正己烷和丙酮等[14]，其中苯的沸点低，挥发性大且具有强烈毒性，易造成二次污染且对人体有害；环己烷提取回收率并不高，且大多需要固相萃取柱净化富集，导致样品前处理过程中步骤复杂，实验过程较长。本实验中样品采用乙腈作为提取溶剂，回收率较高，无需超声提取过程，所用试剂种类少，操作步骤简单，得到色谱图中的色谱峰形对称性好，杂质干扰峰少且不干扰实验测定。刘晓晨等[15]采用HPLC-FLD检测海产品中BaP及其代谢产物的实验中，采用乙腈溶剂提取海产品中的BaP，实验结果显示采用乙腈溶剂提取样品，回收率较高，且检测出的杂质干扰峰少，所用试剂种类少，操作步骤简单。此结果与我们的实验结果相一致，均显示了乙腈作为溶剂提取BaP的优越性。

综上，本实验所建立的HPLC-FLD可以将BaP与其内源性杂质进行良好分离，从而准确检测样品中BaP的浓度，实验成本低、操作简便、快捷、准确度高，同样适用于生物样品中微量BaP的检测，为科学评估胚胎的环境污染物提供了更有效、全面、直观的途径和实验方法，有助于进一步开展BaP的生殖毒性研究。