二倍体马铃薯花粉离体萌发条件的筛选*

唐飞， 李富婷， 艾菊， 高蒙， 李云海， 李灿辉， 马玲

(云南师范大学 生命科学学院,马铃薯科学研究院，云南 昆明 650500)

马铃薯(SolanumtuberosumL.)为茄科茄属(SolanumL.)一年生草本植物，原产于南美洲安第斯山区，是世界第三大粮食作物[1-4]，其营养丰富，生长周期耗水量小，因此在偏远缺水地区也能产生较高的经济效益，是我国脱贫攻坚的助力产业.由于四倍体马铃薯育种周期漫长且种薯繁殖是多代无性繁殖过程，易积累病毒[2]，而且种薯的脱毒、存贮和运输成本高，因此二倍体实生种子育种逐渐被越来越多的育种工作者所关注[2-5,12].

花粉活性测定及离体萌发的研究对雄配子的生物学研究、提高杂交效率和亲本利用率都具有重要意义[6].但当前对花粉管体外萌发的研究大多是针对四倍体马铃薯展开的[7-10].由于遗传背景不同等因素，四倍体和二倍体马铃薯的花粉管体外萌发的最适条件可能并不相同，研究将探索二倍体马铃薯体外花粉管萌发的最适条件，以期为二倍体马铃薯的雄配子生物学研究和杂交育种工作提供有益参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料

采用二倍体马铃薯E 和34-28杂交后，挑选出花期早且开花数量多的单株E172，收获E172的薯块.将E172的薯块种植于云南师范大学马铃薯科学研究院实验基地，栽培方式和田间管理均按照常规方式进行.盛花期时在晴天上午十点到十一点之间收集新鲜花药，装入灭菌的2 mL离心管中，用锡箔纸包裹，置于冰盒中带回实验室进行后续操作.

1.2 实验方法

1.2.1 材料处理及染色

采用2,3,5-三苯基四唑化氢(TTC)染色法[2]测定花粉活性.将收集的花药用 70%的乙醇消毒后，在超净工作台上用75%乙醇消毒后的尖头镊子从花蕾中剥离出花粉，将剥离的花粉放在已消毒的载玻片上，用 TTC染液染色15 min后在显微镜下观察，观察 3个不同的视野，记录视野里总花粉数及染上色的花粉数，计算花粉活性.在显微镜下，经TTC染液染色后，活性正常的花粉粒被染成红色，大小均匀且饱满，而无活性花粉粒为无色，瘪粒.根据花粉活性检测确定的高活性花粉将用于后续的花粉离体培养.

1.2.2 花粉离体培养及萌发率的测定

经花粉活性测定后，采集花粉活性高的花蕾，用70%的乙醇消毒后，在超净工作台上用75%乙醇消毒的尖头镊子从花蕾中剥离出花药，放在已高压灭菌的滤纸上，用解剖针轻轻挑出花粉粒.Ca2+和硼酸是马铃薯花粉离体萌发的必要物质，所以实验以含0.05 g/L CaCl2、0.01%硼酸和0.05 g/L琼脂的培养基为基本培养基，取5 mL基本液体培养基倒入90 mm的无菌培养皿中，将花粉粒倒入培养基中充分混匀，在黑暗的恒温培养箱中培养，每个处理均设置3个重复试验.培养结束后在显微镜下观察花粉萌发情况，以视野内清晰并且花粉管伸长的长度是否超过花粉粒直径为花粉是否萌发的标准，每个重复随机选取5个不同视野进行计数，计算各个培养条件下的花粉平均萌发率.

1.2.3 花粉离体萌发最适培养基的筛选

(1)适宜温度筛选：设置 22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃和30 ℃ 共5个培养温度，其他培养条件不变，筛选出花粉离体萌发的适宜温度.

(2)适宜蔗糖浓度筛选：以基本培养基为试验对照，在基本培养基中分别加入13%、 15%、17%、19%和21 % 的蔗糖进行试验，在无光照的恒温培养箱中培养，筛选出适宜花粉离体萌发的蔗糖浓度.

(3)适宜硼酸浓度筛选试验：利用(1)和(2)筛选出的适宜蔗糖浓度和培养温度，在培养基中分别加入 70 mg/L、80 mg/L、90 mg/L、100 mg/L和110 mg/L的硼酸作为试验组，以培养基中不加硼酸为对照组，黑暗培养并筛选花粉离体萌发的适宜硼酸浓度.

2 结果与分析

2.1 花粉活性测定

TTC(2,3,5-三苯基四氮唑)是一种常用的氧化还原染料，当TTC进入到细胞后，会与活细胞内的脱氢酶结合后接受游离的氢离子，最终由无色的氧化型化合物变成了红色的还原型化合物，利用这个机理，就可判断出二倍体马铃薯E172的花粉活性.红色且饱满的花粉具有活性，无色、黑色或不饱满的花粉无活性.

A：活性正常的花粉粒；B：活性不正常的花粉粒

图1TTC法检测花粉活性

Fig.1TTC method for detecting pollen activity

2.2 不同培养温度对二倍体马铃薯E172花粉离体萌发的影响

不同培养温度对二倍体马铃薯E172花粉离体萌发的影响如表1所示.当培养温度为22 ℃～28 ℃时，随着培养温度的不断升高，花粉离体萌发率呈现出逐渐上升的趋势，但当温度达到30 ℃时，萌发率下降了6.51%.二倍体马铃薯花粉萌发在28 ℃时萌发率达到最大值65.12%，是22 ℃培养条件的2.44倍，因此以下试验培养温度均采用28 ℃.

表1 不同温度处理的花粉萌发状态

2.3 不同蔗糖浓度对二倍体马铃薯E172花粉萌发的影响

蔗糖在植物生长发育过程中不仅作为一种重要的营养物质，而且在花粉萌发及花粉管细胞壁合成和伸长过程中发挥重要作用.在花粉离体培养过程中，蔗糖能提供足够的碳源，并调节细胞内外的渗透压，让细胞保持膨胀状态，为花粉粒萌发提供良好的胞外环境.如果培养基中蔗糖浓度偏低，花粉粒细胞吸水过多会导致胞内外渗透压不平衡，造成花粉细胞破裂；若蔗糖浓度偏高，会造成花粉细胞大量失水，影响花粉萌发和花粉管生长过程，最终导致花粉萌发率下降.

如表2所示，当蔗糖浓度低于17%时，蔗糖浓度升高有助于二倍体马铃薯花粉粒萌发，当培养基中蔗糖浓度为17%时，花粉萌发率达到70.97%.但当蔗糖浓度高于17%后，花粉萌发率开始下降，说明17%的蔗糖浓度是最适花粉管萌发浓度.

表2 不同蔗糖浓度处理的花粉萌发状态

A：0%； B：13%；C：15%；D：17%；E19%；F：21%

图2不同蔗糖浓度花粉管萌发情况

Fig.2The conditions of pollen germination treated with different sucrose concentrations

2.4 硼酸浓度对二倍体马铃薯花粉萌发的影响

大量的研究表明,硼是花粉萌发和花粉管生长所必需的物质[11-12]，硼不仅可增加糖的吸收、转运和代谢，形成花粉管顶端生长依赖的 Ca2+浓度梯度，还会影响到一些关键酶的活性，进而影响花粉管细胞壁的合成及延展性.

不同硼酸浓度对二倍体马铃薯花粉萌发的影响如表3所示，硼酸浓度为70-100 mg/L的范围内时，硼酸浓度的升高有助于二倍体马铃薯花粉粒萌发.随着硼酸浓度增加至110 mg/L时，花粉萌发率比100 mg/L时下降了12.41%.这说明适宜二倍体马铃薯花粉萌发的最适硼酸浓度为100 mg /L，花粉萌发率达到52.68%.

表3 不同浓度硼酸处理的花粉萌发状态

A：0 mg/L;B：70 mg/L;C：80 mg/L;D：90 mg/L;E：100 mg/L;F：110 mg/L

3 讨 论

当前，衡量花粉生活力状态主要是依据花粉活性和花粉萌发率两个指标.花粉活性和花粉的离体萌发一方面受到自身遗传和生长发育等内部因素的影响；另一方面也受到了培养基组分、培养温度及光照等外部因素的影响[13-14].大量文献报道了在不同植物花粉离体萌发过程中Ca2+、蔗糖、硼酸、温度及各类生长激素等因素的作用[15-19].马铃薯花粉离体萌发和花粉管伸长只有在适宜的培养基组分浓度下才能进行[20].二倍体马铃薯种质资源丰富，不同品系的花粉生活力也存在较大的差异，且花粉活性受到花粉发育时期的影响，因此探究二倍体马铃薯花粉离体培养条件对于二倍体马铃薯雄配子体生物学研究具有重要意义.

正常活性的花粉是进行花粉离体培养的前提条件.不同二倍体品系的马铃薯花粉活性有较大的差异，主要表现为花粉形态不同以及成熟周期不同，所以在同一时间内，花粉活性不高的品系进行体外萌发试验时，萌发率也会受到影响.蔗糖和硼酸是二倍体马铃薯花粉萌发和花粉管生长所必需的，是花粉离体培养基的主要成分.研究发现，在28 ℃暗培养条件下，二倍体马铃薯E172的花粉体外萌发的最适硼酸浓度为 100 mg/L，最适蔗糖浓度为17%.这与吴旺泽[15]等研究的马铃薯花粉离体培养条件相似.

研究通过一系列试验筛选出了适宜二倍体马铃薯E172的花粉体外萌发及生长所需的最适培养温度及蔗糖和硼酸的浓度，研究结果可为针对二倍体马铃薯E172的雄配子体生物学研究提供有益参考.