内质网应激对白藜芦醇代谢的影响

姜佳蕾，蒋昆谕，牛慧敏，董松涛，王诗琪，孟胜男

（中国医科大学药学院药剂教研室，沈阳 110122）

内质网是细胞蛋白质合成和折叠的重要场所。各种生理或病理因素都能干扰蛋白质合成过程，从而使未折叠和错误折叠蛋白在腔内聚集，引起内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）［1-2］。ERS是慢性代谢疾病的重要标志，也是连接免疫系统与代谢系统的桥梁［3-4］，但ERS对药物代谢是否有影响目前尚不清楚。肝脏是最重要的代谢和解毒器官，肝细胞富含内质网，是ERS最为敏感的细胞之一［5］。目前，ERS对药物Ⅰ相代谢影响的研究比较活跃［6］，但ERS对药物Ⅱ相代谢影响的研究较少。随着药物代谢研究的深入和发展，药物Ⅱ相代谢对药物处置的重要性越来越受到重视［7］。尿苷二磷酸葡萄糖酸转移酶（UDP-glucuronosyltransferases，UGTs）是最重要的Ⅱ相药物代谢酶，UGTs介导的葡萄糖醛酸化结合反应对药物的生物利用度、解毒及药物相互作用等有非常重要的作用［4，8-9］。肝脏中的UGTs表达量很高，且位于内质网膜上，如果机体发生ERS，可能会直接造成UGTs表达和活性的改变。白藜芦醇具有抗肿瘤、免疫调节及类雌激素样活性等广泛的药理作用［10］，是目前新药开发研究中极具应用前景和临床价值的热点化合物之一［11］。研究［12-13］显示，白藜芦醇的体内外代谢模式主要是UGTs介导的Ⅱ相代谢，且UGT1A1及UGT1A9在其代谢中发挥重要作用。因此，本研究选择白藜芦醇作为模型药物，以考察ERS对白藜芦醇代谢的影响，并探讨ERS是否对UGTs介导的葡萄糖醛酸化代谢产生影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物及试剂：反式-白藜芦醇（98%，上海诺特生物科技有限公司）；毒胡萝卜素（thapsigargin，Tg，98%，美国APExBIO公司）；蛇床子素（98%，大连美伦生物技术有限公司）；Bip抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；UGT1A1抗体、UGT1A9抗体（中国Absin公司）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ig（H+L）二抗（中国ABBKIN公司）；HepG2细胞正常组裂解液及Tg诱导模型组裂解液（自提，1.28 mg/mL）；辅因子UDPGA、丙甲菌素（美国Sigma-Aldrich公司）；DMEM、胎牛血清、胰酶（美国Invitrogen公司）；非必需氨基酸、青-链霉素双抗溶液（美国Hyclone公司）；乙腈（色谱纯，天津康科德公司）；其他试剂为分析纯，超纯水。

1.1.2 仪器：UPLC-Waters，Waters 2996 PDA检测器（美国Waters公司）；Aquasonic 150D超声波仪（美国VWR Scientific公司）；凝胶成像系统（以色列DNR公司）。

1.2 方法

1.2.1 ERS细胞模型制备：用含10%胎牛血清的DMEM培养液在37℃、5% CO2恒温培养箱中培养肝癌HepG2细胞（本实验室保存）。取对数期HepG2细胞，随机分为正常组和模型组，模型组细胞用1 μmol/L Tg 处理24 h，诱导制备ERS模型，收集细胞。

1.2.2 Westem blotting检测葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein，GRP78）表达水平的变化：裂解HepG2野生型及诱导型细胞，收集蛋白。行SDSPAGE（分离胶浓度12% ），转膜，5% 脱脂奶粉封闭1 h；分别加入GRP78、UGT1A1、UGT1A9的多克隆抗体，4℃缓慢震荡孵育过夜；洗膜后，加入山羊抗兔二抗，室温孵育1 h；再次洗膜后，ECL发光显像。GAPDH作内参照蛋白。

1.2.3 色谱：色谱柱为 CQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）；流动相为乙酸铵水溶液（A）（2.5 mmol/L，pH7.4），乙腈（B）（色谱级）。采取梯度洗脱，0～0.5 min，7% B；0.5～1.5 min，7%～15% B；1.5～3.5 min，15%～50% B；3.5～4.0 min，50%～85% B；4.0～4.5 min，85%～7% B；4.5～6.0 min，7% B；进样量10 μL，流速0.25 mL/min，柱温35℃，内标为蛇床子素。

1.2.4 样品处理及体外孵育实验：

1.2.4.1 细胞培养及细胞裂解液的制备 胰酶消化融合达90%～95%的HepG2细胞，将细胞混悬液（2×105/mL）种植于10 cm培养皿中，培养3 d，PBS洗3次，加入1 mL PBS后将细胞刮下，4℃ 3 000 r/min 离心8 min，在冰冷水浴中用Aquasonic 150D超声波仪以最大功率（135平均瓦特）的短脉冲超声处理细胞悬浮液8 min，收获所得细胞裂解液并测定浓度。

1.2.4.2 白藜芦醇肝细胞裂解液体外葡萄糖醛酸化代谢孵育实验 制终浓度分别为100、500、1 000 μmol/L的白藜芦醇-甲醇溶液。分别取白藜芦醇的储备液，KPI缓冲溶液、UGDPA、丙甲菌素、细胞裂解酶蛋白按3∶186∶42∶53∶16混合，反应体系总体积为200 μL，37 ℃恒温振荡水浴箱中孵育，根据反应速率设定不同的孵育时间。孵育结束后立即取出置于冰浴中，加冰甲醇终止反应，加入内标蛇床子素溶液50 μL，4℃、15 000 r/min离心20 min，取上清进行色谱检测（检测波长306 nm）。

1.3 统计学分析

采用 GraphPad Prism 5.0统计软件进行统计学分析。所有数据点均为3次测定的平均值，以表示。2组间差异比较采用Student’st检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ERS细胞模型的验证

通过Western blotting检测ERS标志性蛋白GRP78的表达变化，验证模型是否构建成功。结果显示，经Tg诱导的模型组HepG2细胞中GRP78蛋白表达增加至正常组的7.35倍，差异有统计学意义（P＜ 0.001），证明ERS细胞模型构建成功，见图1。

图1 Tg对HepG2细胞GRP78蛋白表达水平的影响Fig.1 The effect of Tg on the expression of GRP78 in HepG2 cells

2.2 ERS对UGT1A1和UGT1A9蛋白表达的影响

与正常组相比，模型组HepG2细胞中Ⅱ相药物代谢酶UGT1A1、UGT1A9蛋白表达分别增高了1.96倍、1.47倍，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见图2。表明ERS可以上调UGT1A1、UGT1A9的蛋白表达。

2.3 ERS对白藜芦醇葡萄糖醛酸化代谢反应速率的影响

细胞裂解液孵育实验结果显示，白藜芦醇在正常组HepG2中有代谢产物生成，而在模型组中代谢产物则很少（图3）。白藜芦醇药物浓度为100、500、1 000 μmol/L时，正常组代谢速率分别是模型组的61.89倍、25.58倍、20.21倍，有统计学差异（P＜0.001），见图3。证实ERS可导致白藜芦醇的葡萄糖醛酸化代谢显著减弱。

3 讨论

图2 Tg对HepG2细胞UGT1A1和UGT1A9蛋白表达水平的影响Fig.2 The effect of Tg on the expression of UGT1A1 and UGT1A9 in HepG2 cells

图3 白藜芦醇在正常组和模型组HepG2细胞裂解液中孵育的葡萄糖醛酸化代谢速率Fig.3 Glucuronidation metabolism rate of resveratrol in wild-type HepG2 cell lysate and Tg-induced cell lysate

肝脏是机体最重要的药物代谢器官，内、外源性化合物（包括药物和毒物）通过Ⅰ相和Ⅱ相代谢完成生物转化。肝脏富含药物Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶，介导Ⅰ相和Ⅱ相代谢的2个非常重要的酶系，即细胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450）和UGTs均定位于肝细胞内质网中。因此，内质网功能的正常维持对药物代谢具有重要的生物学意义。研究［14］证明，肝损伤及疾病，如肝纤维化、病毒性肝炎、药物性肝炎、非酒精性脂肪肝等可以影响药物代谢酶的表达和功能，且这些损伤和疾病都会引发ERS。因此，明确ERS对药物代谢的影响，对临床提高药物疗效、减少药物不良反应、避免药物相互作用具有重要意义，也是药物精准治疗的迫切需要。

本研究重点探讨了ERS对Ⅱ相药物代谢酶UGTs表达和功能的影响。本研究选用了肝癌HepG2细胞，原因在于肝脏是人体内最重要的代谢和解毒器官。由于正常人体肝脏的细胞株奇缺或难于购买，故本研究选择了目前药物代谢研究中应用广泛、非常活跃、稳定且癌性较低的HepG2细胞。另外，研究［15］证实，HepG2细胞中有较完整的Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶的表达，这是选择该种细胞的另一个重要原因。

本研究仅从多个UGTs亚型中选择了UGT1A1和UGT1A9作为研究对象，是由于有多篇文献［16-17］证实两者是白藜芦醇的主要代谢酶。本研究结果显示，ERS可导致这2种主导代谢酶的表达发生显著改变，并且UGTs介导的酶学孵育实验结果也证实白藜芦醇代谢速率的变化趋势与UGT1A1和 UGT1A9蛋白表达变化的趋势一致。提示ERS条件下UGT1A1和UGT1A9仍在白藜芦醇的代谢中发挥主要作用。后续研究将通过应用UGT1A1或 UGT1A9抑制剂及靶基因调控实验进一步确定2种酶的具体作用机制。

目前，常用的制备ERS细胞模型的诱导剂有衣霉素和Tg。但由于UGT1A9的活性可受衣霉素造成的非糖基化影响而失活，而Tg没有非糖基化效应［18］。因此，本研究选择Tg作为ERS模型制备的工具药。

总之，本研究结果证实，ERS可引起UGTs介导的白藜芦醇Ⅱ相代谢发生变化。今后将深入探究ERS对其他Ⅱ相代谢的影响，并综合阐释ERS对药物代谢的作用。