双链DNA与急性ST段抬高型心肌梗死的相关性分析

王西强，杨丹丹，刘静，范修德，马爱群，4，5，刘平

（1.西安交通大学第一附属医院心血管内科，西安 710061；2.浙江大学医学院第二附属医院心血管内科，杭州 310000；3.西安交通大学第一附属医院感染性疾病科，西安 710061；4.陕西省分子心脏病学重点实验室，西安交通大学，西安 710061；5.环境与疾病相关基因教育部重点实验室，西安 710061）

在冠状动脉病变的基础上，斑块破裂、血栓碎片释放入血，内源性和外源性凝血途径启动，以及随后冠状动脉内血栓形成，是急性心肌梗死发生发展的病理生理学基础，其中中性粒细胞发挥了重要作用［1-2］。研究［3］发现，在动脉粥样硬化的进程中，循环中性粒细胞及构成血管壁的细胞DNA更容易受到损伤，受损细胞通过细胞程序性死亡释放出大量胞外DNA和核小体。通过这种特殊的细胞程序性死亡［4］，中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞等释放出球状颗粒串于丝状纤维上，并相互缠绕成网状陷阱样结构，即中性粒细胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs），并促进急性心肌梗死时冠状动脉内血栓形成。NETs结构上的丝状纤维主要由细胞核内的DNA 去致密化而来，为非浓缩的双链脱氧核苷酸（double-stranded DNA，dsDNA）纤维，丝状纤维dsDNA构成了NETs的骨架结构［4-5］。有研究［6-9］发现，NETs具有重要的抗感染作用，并在自身免疫性疾病、肿瘤、深静脉血栓、败血症的发生发展中具有重要作用。近期，BORISSOFF等［10］研究发现，在冠状动脉粥样硬化疾病状态下，由体内免疫细胞释放的dsDNA与严重冠状动脉粥样硬化性患者的预后相关，并且可能是促进冠状动脉粥样硬化心脏病发生的病理生理基础。但dsDNA是否与急性ST段抬高型心肌梗死（acute ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI）发生相关仍属未知。本研究拟通过分析STEMI患者dsDNA含量与心肌梗死相关指标，探讨dsDNA与STEMI发生的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2015年6月至12月发病12 h内入住西安交通大学第一附属医院心血管内科重症监护室的STEMI患者共145例，以及健康对照者3例。标本采集前告知并征得研究对象或其委托人同意，并签署知情同意书。本研究经西安交通大学第一附属医院伦理委员会批准，并在其监督下完成。

纳入标准：根据最新中国STEMI诊断及治疗指南［11］诊断为STEMI，发病12 h内，并接受急诊冠状动脉支架植入术开通罪犯血管的患者。排除标准：伴肾功能不全且血清肌酐＞ 20 mg/L；伴肝炎、肝硬化，近期出现或持续存在的肝功能异常；伴骨关节炎、类风湿性关节炎、溃疡性肠病、肌炎/肌病、系统性红斑狼疮等系统性疾病；有瓣膜性心脏病、持续性心房纤颤等心血管疾病；不同意及不配合完成本研究者。

1.2 研究方法

1.2.1 记录基线资料：包括性别、年龄、身高、体质量、既往病史等基本资料。

1.2.2 采集标本：STEMI患者入院后立即于桡动脉或股动脉处取外周动脉血，于术中采集梗死相关冠状动脉血；采集健康对照者外周动脉血。采用EDTA抗凝管取血。

1.2.3 检查生化指标：抽血后立即送检血常规、肝肾功、心肌酶谱、肌钙蛋白、血脂全套等常规检查，使用Sysmex XE-5000全自动血液分析仪及配套试剂进行检测。

1.2.4 分离STEMI患者冠状动脉血、外周动脉血及正常人外周血中性粒细胞：采用中性粒细胞分离试剂盒进行分离。向15 mL离心管中加入试剂A 5 mL，向分离液液面上加入血液标本，500～550g高速离心10 min，可见离心管中标本分为单个核细胞层及中性粒细胞层，吸取离心管中中性粒细胞。若中性粒细胞中混杂有红细胞，则加入红细胞裂解液，即可得目的细胞。转移目的细胞至一新的15 mL离心管，并加入10 mL清洗液，250g高速离心10 min，获得目的细胞。

1.2.5 免疫荧光染色观察STEMI患者梗死相关动脉、外周动脉及健康对照者外周动脉NETs结构并计数分析：4%多聚甲醛固定中性粒细胞30 min，用0.1%TX-100作用于中性粒细胞5 min，使细胞膜通透，用BSA封闭1 h，一抗孵育过夜。用PBS清洗细胞，使用DAPI对中性粒细胞细胞核进行着色，封片，使用荧光显微镜观察NETs结构，对不同视野下NETs结构进行计数，并计算NETs结构占总细胞数比例。

1.2.6 检测梗死相关动脉及外周动脉血浆中NETs相关结构dsDNA含量：使用荧光染料Sytox Green DNA检测。将标准品与样品按照试剂盒说明书稀释后，用含有0.1%BSA的PBS将血浆标本稀释50倍，用100 μL荧光染料与等体积的稀释样品混合后，加入96孔板中，最终标准品的终浓度为1，0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 25，0.015 625，0 μg/mL。在激发光为488 nm，发射光为525 nm处，使用荧光读数仪检测信号强度，标本加完后尽快上机，以防止荧光淬灭。

1.3 统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用表示，不符合正态分布的计量资料采用中位数表示。2组计量资料符合正态分布及方差齐性的比较采用两独立样本t检验，2组计量资料不符合正态分布与方差齐性的比较采用非参数Mann-WhitneyU检验。满足双变量正态分布资料采用Pearson相关系数分析；不满足双变量正态分布或等级资料采用Spearman相关分析。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 STEMI患者基线资料

入组STEMI患者的基线资料见表1。

2.2 免疫荧光染色结果

梗死相关冠状动脉中可见大量NETs骨架结构生成，见图1。选取不同视野计数NETs骨架结构占总细胞数比例并进行统计学分析，结果显示，STEMI患者梗死相关冠状动脉中NETs骨架结构（32.33%±4.6%）明显多于STEMI患者外周动脉及健康对照者外周动脉（17.87%±1.017%，7.55%±1.95%），差异有统计学意义（P=0.037，P=0.027），见图2。

2.3 免疫酶标仪定量分析结果

表1 STEMI患者基线资料Tab.1 Clinical baseline data in STEMI patients

图1 免疫荧光染色观察NETs的生成 ×20Fig.1 Analysis NETs formation by immunofluorescence staining ×20

图2 梗死相关冠状动脉、外周动脉及健康对照者外周动脉NETs生成量Fig.2 Neutrophil extracellular traps of polymorphonuclear neutrophils obtained from infarct-related coronary artery，peripheral artery，and control peripheral artery

用荧光分光光度仪测定标准品和外周动脉血游离dsDNA含量，绘制标准曲线，R2=0.998 1，见图3。STEMI患者冠状动脉中dsDNA含量明显高于STEMI患者外周动脉，差异有统计学意义（P=0.038）。

图3 dsDNA标准曲线Fig.3 Standard curve of dsDNA

2.4 dsDNA与心肌梗死相关指标的散点图分析

dsDNA与磷酸肌酸激酶（creatine kinase，CK）、磷酸肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB）、肌钙蛋白T（troponin T，cTnT）、白细胞（white blood cell，WBC）检测结果行散点图分析，结果见图4。

2.5 dsDNA与心肌梗死相关指标的相关性分析

图4 磷酸肌酸激酶、磷酸肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白T、白细胞计数与dsDNA散点图Fig.4 Scatter chart of dsDNA and CK，CK-MB，cTnT and WBC

相关性分析结果显示，CK、CK-MB、cTnT、WBC与dsDNA含量呈正相关，差异有统计学意义，见表2。

3 讨论

STEMI是冠状动脉粥样硬化性心脏病患者死亡的主要原因［12-13］，其发生机制尚不清楚［1，14］。研究显示，循环中的WBC，特别是单核细胞在动脉粥样硬化血栓形成过程中起重要作用［15］，且中性粒细胞是急性心肌梗死患者死亡的独立预测因子［16］；中性粒细胞在急性心肌梗死患者冠状动脉血栓中大量聚集［17］，并且是预测急性心肌梗死患者远期预后的重要指标［17-19］。但中性粒细胞如何参与上述疾病的发生仍有待进一步探讨。

表2 心肌梗死相关指标与外周动脉血浆dsDNA相关性分析Tab.2 Correlation between dsDNA and indicators of myocardial infarction

既往研究［4］显示，中性粒细胞可以通过形成NETs捕获并杀灭病原体。近期的研究［20］发现，NETs不仅对感染性疾病具有保护作用，而且还在动脉粥样硬化以及动脉粥样硬化血栓形成中具有重要作用。本研究检测了STEMI患者梗死相关冠状动脉、外周动脉血中NETs骨架结构、dsDNA含量，结果显示，STEMI患者梗死相关冠状动脉血中NETs骨架结构明显多于STEMI患者外周动脉及健康对照者外周动脉，且STEMI患者冠状动脉中NETs骨架结构dsDNA含量明显高于STEMI患者外周动脉，差异有统计学意义。并对dsDNA含量与心肌酶谱、cTnT、WBC等提示STEMI发生的相关性指标行相关性分析，结果显示，CK、CK-MB、cTnT、WBC与血浆中dsDNA呈正相关，且差异有统计学意义，提示中性粒细胞可能以NETs的形式参与了STEMI的发生，NETs的骨架结构dsDNA可能与STEMI的发生相关，可能为治疗STEMI提供新的思路与靶点。

研究［20］发现，应用动脉粥样硬化小鼠模型，可见中性粒细胞在胆固醇结晶的刺激诱导下形成NETs，巨噬细胞被NETs激活并分泌相关细胞因子，如白细胞介素-1β，在相关细胞因子的作用下，辅助性T细胞17被激活，扩大免疫细胞在粥样硬化灶的聚集，引起慢性炎症反应，为NETs参与冠状动脉粥样硬化的形成、斑块炎症活动提供了可能的机制。研究［21］显示，过度产生的循环DNA、核小体和组蛋白等NETs相关结构在血栓形成、肺炎以及败血症中能够促进疾病的发展，加重病情。由于强有力的细胞毒和促血栓形成作用，胞外DNA可能是炎症和血栓形成之间的桥梁。而且在急性心肌梗死中，中性粒细胞可释放NETs，并暴露有活性的组织因子，激活外源性凝血途径，从而促进急性心肌梗死时血栓的形成［22］。在动脉粥样硬化中，胆固醇刺激NETs的生成，NETs参与并扩大慢性炎症反应，胞外DNA作为炎症和血栓之间的桥梁，促进急性心肌梗死时血栓形成，可能是NETs致STEMI发生的主要机制。因此，中性粒细胞可能以NETs的形式参与了STEMI的发生。