miR-15a-5p和MDR1在大肠癌组织中的表达及临床意义*

黄艳洁，袁亚男，李 璐，许 倩，郑纪宁

（承德医学院，河北承德 067000）

大肠癌(colorectal carcinoma，CRC)是常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年升高。2018年，美国癌症协会发布的统计报告指出，全球范围内大肠癌的发病率位于第四位，死亡率位于第二位[1]。近年来越来越多的研究表明，大肠癌的发生发展与微小RNA（microRNA，miR）有关。microRNA是一类非编码小分子单链RNA，通过调控靶基因表达，影响肿瘤的发生、发展进程。其中的miR-15a可抑制多种肿瘤细胞的增殖、迁移、凋亡等，并在多种肿瘤中低表达，如骨肉瘤[2]、胃癌[3]、卵巢癌[4]等，但目前miR-15a-5p与大肠癌的关系尚不清楚。多药耐药基因1(multidrug resistancegene1，MDR1)与肿瘤的多药耐药密切相关，其编码的P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)可通过ATP释放的能量将细胞内药物泵至细胞外，降低药物在细胞内的浓度，导致化疗效果下降[5]。有研究发现[6]，miR-15a-5p可能对MDR1有调控作用，但大肠癌组织中miR-15a-5p与MDR1关系的研究尚未见报道。为此，本研究检测了大肠癌组织中miR-15a-5p与MDR1的表达情况，并分析了大肠癌组织中二者的相关性，以期为大肠癌的临床治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 标本收集 2017年10月-2019年3月，在承德医学院附属医院及承德市中心医院行大肠癌根治术的大肠癌患者44例。入选标准：均行手术治疗；行手术治疗前均未进行放化疗或其它辅助治疗；病历资料保存完整。排除标准：非原发性大肠癌；存在其它部位肿瘤。

每例标本均包括大肠癌组织，以及对应的距离肿瘤边缘超过5cm的癌旁正常肠黏膜组织，且所有患者均经术后组织病理检查确诊。44例患者中，男21例，女23例；年龄38～75岁，中位年龄65岁；组织分化程度：高、中分化34例，低、未分化10例；肿瘤浸润深度：未浸透浆膜层16例，浸透浆膜层28例；有淋巴结转移30例，无淋巴结转移14例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期13例，Ⅲ、Ⅳ期31例。本研究经承德医学院附属医院及承德市中心医院医学伦理委员会批准，患者或其家属均知情同意。

1.2 miR-15a-5p、MDR1 mRNA表达的检测 采用实时荧光定量PCR法。取液氮保存的大肠癌组织及癌旁正常肠黏膜组织，置于经DEPC水处理的匀浆器中，加入1ml Trizol冰上充分匀浆，常规提取组织总RNA，经Nanodrop 2000分光光度计检测，A260/A280为1.8～2.1，可用于后续实验。采用20μl逆转录反应加样量体系进行逆转录获得cDNA。取总RNA 2μg，miR-15a-5p按照Tiangen miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit试剂盒说明将其逆转录为cDNA，MDR1 mRNA按照Tiangen FastQuant cDNA试剂盒说明将其逆转录为cDNA，然后进行PCR扩增。所有引物由大连宝生物工程有限公司设计合成。荧光定量PCR采用SYBR Green法，miR-15a-5p扩增用miRcute Plus miRNA qPCR Kit试剂盒，MDR1 mRNA扩增用SuperReal PreMix Plus试剂盒。反应体系共20μl。miR-15a-5p反应条件：95℃预变性15min后，94℃ 20s、60℃ 34s，共44个循环；MDR1 mRNA反应条件：95℃ 60s，1个循环，95℃ 15s，60℃ 15s，40个循环。扩增反应在Bio-Rad公司CFX96型Real-time PCR仪检测系统中进行，检测miR-15a-5p表达以U6为内参，检测MDR1 mRNA表达以GAPDH为内参。

引物序列：miR-15a-5p上游引物5’-UAGCAGCACA UAAUGGUUUGUG-3’，下游引物为试剂盒中通用引物；U6上游引物5'-AGAGAAGATTAGCATGGACCCTG-3'，下游引物5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'；MDR1上游引物5'-GGAGCCTACTTGGTGGCACATAA-3'，下游引物5'-TGGCATAGTCAGGAGCAAATGAA-3'；GAPDH上游引物5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物 5'-TGGTGAAGACGCCAGT-3'。

计算目的基因相对表达量采用2-△△Ct法。每个样本设3个复孔，复孔间Ct值差异≤0.5，否则重复该样本实验。

1.3 观察指标 分析大肠癌组织与癌旁正常肠黏膜组织miR-15a-5p mRNA与MDR1 mRNA的表达情况，大肠癌组织中miR-15a-5p mRNA表达与MDR1 mRNA表达的相关性，以及miR-15a-5p、MDR1 mRNA表达与大肠癌临床病理特征的关系。

1.4 统计分析 采用SPSS 19.0统计软件。非正态分布的计量数据以中位数（四分位数间距）表示，配对数据采用Wilcoxon检验方法，两组样本比较采用Mann-Whitney U检验方法。相关性分析采用Spearman相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大肠癌组织与癌旁正常肠黏膜组织miR-15a-5p、MDR1 mRNA表达比较 以U6为内参，miR-15a-5p在大肠癌组织中的表达量为0.51（0.25），明显低于癌旁正常肠黏膜组织[1.17（2.95）]，差异有统计学意义（P＜0.05）；以GAPDH为内参，MDR1 mRNA在大肠癌组织中的表达量为2.21（4.07），明显高于癌旁正常肠黏膜组织[1.13（2.28）]，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 大肠癌组织miR-15a-5p表达与MDR1 mRNA表达的相关性 Spearman相关分析显示，大肠癌组织miR-15a-5p表达与MDR1 mRNA表达呈负相关关系（r=-0.343，P＜0.05）。

2.3 miR-15a-5p、MDR1 mRNA表达与大肠癌临床病理特征的关系 miR-15a-5p表达与性别、年龄、分化程度、浸润深度无关(P＞0.05)；与淋巴结转移和TNM分期有关(P＜0.05)：有淋巴结转移明显低于无转移，III～IV期明显低于I～II期。MDR1 mRNA表达与性别、年龄、分化程度、浸润深度无关(P＞0.05)；与淋巴结转移和TNM分期有关(P＜0.05)：有淋巴结转移明显高于无转移，III～IV期明显高于I～II期。见附表：

附表 miR-15a-5p、MDR1 mRNA表达与大肠癌临床病理特征的关系

3 讨论

大肠癌是高发病率、高死亡率的恶性肿瘤之一。化疗作为减少进展期大肠癌术后复发转移的重要手段，在临床治疗中起着重要作用，但肿瘤多药耐药性的产生常常会导致化疗失败，严重影响大肠癌的治疗效果。因此，克服多药耐药、提高肿瘤对化疗的敏感性，对临床治疗大肠癌具有重要意义。

miR-15a-5p是miR-15家族的成员，位于人类染色体13q14区，近年研究表明其可以通过靶向结合多种编码基因mRNA的3＇UTR，抑制靶mRNA的翻译或促进靶mRNA的降解，对基因进行转录后调控，从而影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移及多药耐药。GUO等[7]的研究发现，miR-15a在胰腺导管癌中的表达显著降低，并且可通过下调耐药相关因子Bmi-1抑制肿瘤细胞增殖及上皮-间充质转化；BOZOK等[8]的研究发现，miR-15a在非小细胞肺癌中过表达，可增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性；另外，miR-15a还可以调控与凋亡有关的原癌基因(Bcl-2)、与细胞周期有关的基因(Cyclin D1，CyclinE，C-myb，CDCA4)等多个下游靶基因发挥抑癌作用[9-10]。上述研究均表明，miR-15a可作为抑癌基因参与某些恶性肿瘤的发生发展并与肿瘤耐药关系密切。本研究检测了大肠癌及癌旁正常肠黏膜组织中miR-15a-5p的表达情况，发现大肠癌组织miR-15a-5p的相对表达量明显低于癌旁正常肠黏膜组织，提示miR-15a-5p可能作为抑癌基因参与了大肠癌的发生发展。进一步分析不同临床病理特征的大肠癌组织miR-15a-5p的相对表达量发现，有淋巴结转移的明显低于无淋巴结转移者、TNM分期III～IV期的明显低于I～II期者，提示miR-15a-5p可能与大肠癌的发生发展及转移有一定关系，miR-15a-5p可能作为判断大肠癌发生发展的分子生物学指标用于临床。

MDR1基因编码的跨膜糖蛋白P-gp，是经典的ABC转运蛋白家族的一员，能利用ATP水解释放的能量将进入细胞内的化疗药物，如长春新碱、紫杉醇、阿霉素等泵出细胞外，导致细胞内化疗药物浓度降低，从而表现为对化疗药物的耐药[11]。大量研究表明，P-gp在多种恶性肿瘤如胃癌、肺癌及乳腺癌中均有较高表达，并且P-gp的高表达是多种肿瘤细胞产生多药耐药的重要原因之一[12]。本研究采用实时荧光定量PCR法检测大肠癌及癌旁正常肠黏膜组织中MDR1 mRNA的相对表达量，发现在大肠癌中MDR1的相对表达量明显高于癌旁正常肠黏膜组织，提示在大肠癌组织中MDR1基因的转录处于明显激活状态，与以往文献报道相符[13]。分析MDR1与大肠癌临床病理特征的关系发现，有淋巴结转移的明显高于无淋巴结转移者，提示大肠癌的多药耐药与肿瘤转移可能有某种内在联系[12]；另外，TNM分期III～IV期的大肠癌患者MDR1的相对表达量明显高于I～II期者，说明MDR1高表达可能促进大肠癌的发生发展。

本研究进一步分析发现，大肠癌组织miR-15a-5p与MDR1 mRNA表达呈负相关关系，提示在大肠癌组织中miR-15a-5p可能通过抑制MDR1负向调控P-gp的表达从而影响大肠癌多药耐药。

综上所述，大肠癌中miR-15a-5p的表达水平降低、MDR1的表达水平升高，二者均与大肠癌淋巴结转移和TNM分期有关，且大肠癌中二者表达呈负相关关系，表明二者均可能参与了大肠癌的发生发展过程。但本研究样本量较少，且仅从组织水平进行了观察，后续将扩大样本量并从细胞水平进行具体机制的研究。