Rh缺失型D--个体及家庭成员的血型鉴定与遗传分析

燕 磊，李洁平，赵震焱

（郑州市第二人民医院，河南郑州 450006）

Rh血型系统基因由R H C E基因、RHD基因组成，位于人类染色体1p34.3-1p36.1短臂上，是当前已知的血型系统中除ABO血型以外的具较强免疫原性的血型，并具复杂多态性[1]。Rh缺失型D是Rh血型系统中极为罕见的基因变异型，其红细胞表面仅有D抗原表达，C抗原、c抗原、E抗原、e抗原表达均缺失[2]。在输血医学领域，Rh缺失型D--的个体若被Rh抗原致敏可产生多种Rh抗体针对C抗原、c抗原、E抗原或e抗原，因此发生严重溶血性输血反应[3]。当前，关于Rh缺失型D--的临床报道多为Rh缺失型D--孕妇个体引起的胎儿或新生儿溶血性疾病[4-5]；并且，当前国内关于Rh缺失型D--表型的研究多为个案报道[6]。鉴于此，本研究鉴定分析了本院收治的Rh缺失型D--个体及家庭成员的血清学及遗传背景，旨在为中国人群的血型基因结构、多态性等研究积累更多的临床资料。

1 资料与方法

1.1 病例资料 研究对象为2018年11月在本院分娩后大出血需输血的产妇1名。该名产妇年龄29岁，既往有输血史，孕2胎产2胎。2014年分娩1胎，女婴，健康成活；2018年12月分娩1胎，男婴，男婴产后进行性皮肤黄疸加重。男性新生儿实验室检查红细胞计数1.24×1012/L，Hb 56g/L，网织红细胞比值0.35，有核红细胞140个/100个白细胞，血清总胆红素260.36μmol/L，临床初诊新生儿溶血病(hemolytic disease newborn，HDN)。为查明男婴发生HDN的原因、为产妇提供相配的血液输注，采集产妇及其家属（其夫、患儿、其女、其母、其姐、其兄、其妹，未采集到其父标本）血液标本进行交叉配血检查，标本送达时患儿已因病情过重死亡。

1.2 方法

1.2.1 细胞及试剂：IgM型单克隆抗-A、抗-B、抗-D血清及抗人球蛋白试剂、筛选细胞，均购自上海血液生物医药有限公司；反定型红细胞，购自长春博德生物医药有限公司；谱细胞、IgM型单克隆抗-C、抗-c、抗-E、抗-e血清，购自美国IMMUCOR公司；人源抗-C、抗-c、抗-E、抗-e血清自制；基因组DNA提取试剂盒、PCR-SSPCDE试剂盒，均购自德国Inno-train公司；引物均为上海生物工程公司合成；直接抗人球蛋白试验实验凝胶卡购自西班牙Grifols公司。

1.2.2 血型鉴定：获得研究对象知情同意后采集5ml空腹肘静脉血，制备5%红细胞悬液。试管法鉴定ABO血型、Rh血型，对IgM型单克隆抗-C、抗-c、抗-E、抗-e初筛显示C、c、E或e抗原阴性的标本再次用人源抗-C、抗-c、抗-E、抗-e血清进行吸收放散实验，明确被检红细胞上有无对应抗原；直接抗人球蛋白试验DAT实验凝胶卡对样本进行直接抗人球蛋白（DAT）试验。

1.2.3 基因型分析：严格参照基因组DNA提取试剂盒说明书提取产妇及其家庭成员EDTA抗凝全血中的基因组DNA，调整浓度至50ng/μ l。参照PCR-SSPCDE试剂盒说明书对产妇及其家庭成员RHD基因第1（PCR产物大小124bp，检测基因D1）、2（149305bp，D2、C、D3）、3（139bp，D4）、4（152303bp，D5、psi）、5（130bp，D6）、6（122bp，D7）、7（186bp，D9）、8（147bp，D10）、9（106298bp，C、“W”）、10（145bp，c）外显子，以及RHCE基因特征性片段11（157bp，E）、12（155bp，e）、13（166107124bp，D1Ⅶ、DHMi）、14（166165bp，D1Ⅶ、DAU）、15（139135bp，DNB、697A）、16（139133bp，DNB、697C）进行PCR扩增。反应体系：双蒸水6μl、引物混合物3 μl、Taq酶0.08μl，DNA 1 μl。反应条件：94℃ 20min 1个循环；94℃ 20s、70℃ 60s，5个循环；94℃20s、65℃ 60s、72℃ 45s，10个循环；94℃ 20s、61℃ 50s、72℃45s，20个循环；72℃ 5min ，1个循环；10℃保存PCR产物。取10 μ l PCR产物直接点样于含0.7μg/ml EtBr的2%琼脂糖凝胶，电泳20min，8～10V，凝胶成像系统紫外光下拍照记录，每个反应管内均含434bp内对照物，电泳后所有阴性反应管出现该对照带。

2 结果

2.1 产妇及其家庭成员血型鉴定结果 产妇、其丈夫、患儿、其女、其母、其姐、其兄ABO血型鉴定结果显示均为A型血，其妹为AB型；Rh血型见表1：

表1 被检对象血型鉴定结果

2.2 产妇及患儿的DAT实验及抗人球蛋白试验 产妇DAT实验阴性，患儿DAT实验阳性（++）。抗体鉴定显示产妇、患儿血清与谱细胞在盐水介质中均不凝集，为阴性。产妇抗人球蛋白试验强阳性，在抗人球蛋白试验中与所有细胞均发生强凝集（+++），产妇自身对照无凝集。

2.3 产妇及其家庭成员的RHD基因分型 产妇及其家庭成员PCR结果证实，产妇RHD基因未见异常，亦未检出RHCE基因的特异性序列；其他家庭成员均有正常表型及RHCE基因产物，且产妇及其家庭成员PCR结果与血型学表型基因相符。见表2-3、附图。

表2 PCR-SSP CDE检测试剂盒PCR产物及检测基因

表3 产妇及其家庭成员的RHD基因分型

附图 产妇及其家庭成员的RHD基因分析图

3 讨论

本研究病例个体及家族成员血型鉴定结果显示，产妇、其夫、其子的ABO血型均为A型，可明确排除母婴ABO血型不合引起的HDN；并且，产妇Rh血型为D--，存在C、c、E、e抗原缺失现象，其夫及两子女Rh血型均为D+C+c-E-e+，均有C、e抗原。且结果显示产妇DAT实验阴性，患儿DAT实验阳性（++）；抗体鉴定阴性；产妇抗人球蛋白试验强阳性，抗人球蛋白试验中与所有细胞均发生强凝集（+++），产妇自身对照无凝集。因此，可以排除产妇存在自身抗体。该产妇既往有妊娠及输血史，且既往有研究报道Rh缺失型D--个体通过妊娠、输血或可产生抗抗-Rh17抗体，即针对Rh高频率抗原的抗体，结合患儿HDN实验均为阳性，证实HDN是免疫学原因所致。因此，类Rh缺失型D--血液中存在针对高频抗原的抗体，与一般红细胞均可发生凝集反应，仅与RHD--、Rhnull、Rhmod细胞不反应，因此，寻找相配血液供产妇输注相当困难。这也是本研究采集其家系血清的重要原因，但在产妇家系中并未发现Rh缺失型D--个体。

既往有研究指出[7-8]，Rh缺失型D--多因近亲婚配导致，但对本研究中产妇家系进行调查后发现，该产妇并无明显证据证实其Rh缺失型D--是近亲婚配所致。但基于血清学检查的局限性，许多Rh缺失型D--血清学检测为纯合子，但分子生物学方法检测却为杂合状态，且几乎所有的Rh缺失型D--均至少有一条顺式杂合单倍体[9-10]。为此，本研究进一步采用PCR-SSP技术分析了产妇及其家庭成员的RHD和RHCE基因。结果显示，产妇及其家庭成员的PCR-SSP结果与血型学表型基本符合，RHD基因9个外显子的PCR扩增产物亦均显示为正常RHD基因，并未见RHCE基因插入、互换现象；产妇RHCE基因特异性序列PCR扩增产物分析显示未见RHCE基因特异性序列，提示产妇的RHCE基因极有可能大部分或全部缺失，但其他家庭成员则均有正常RHCE基因表型及RHCE基因PCR产物；同时，PCR产物分析结果还显示其母、其兄皆出现Dpsi条带，与产妇及其姐妹的PCR产物结果矛盾，不能从遗传学角度解释，考虑PCR假阳性。

综上所述，产妇其母、其兄、其姐、其妹及其子、其女均有正常RHCE基因表型，而产妇未见RHCE基因，分析Rh缺失型D--的原因或可能为产妇父母分别携带一条D--单倍型，为RHCE基因缺失型杂合状态，遗传时将D--单倍型遗传给产妇所致。拟在今后的研究中检测该产妇家庭成员的RHD基因、RHCE基因缺失型杂合状态，并对产妇cDNA作RHCE基因全长测序，以深入探究。