混菌固态发酵花生粕的工艺优化

姜晓阳,2,胡迎芬,*,郑靖义,王刘昱,李梦杰,孙榕梓,张 锋

(1.青岛大学生命科学学院,山东青岛 266071;2.青岛大学医学院,山东青岛 266071)

我国是花生生产大国,每年近一半以上的花生用于榨油,故每年能产生上百万吨的花生粕[1-2]。花生粕含有丰富的蛋白质、糖类、膳食纤维和矿物质等营养物质[3-4],但是由于花生粕是在高温高压的条件下产生的,其中的蛋白质和多糖易产生美拉德反应,其营养价值与功能特性受到不同程度的影响[5-7],大大降低了其利用率。根据国家统计局公布的数据显示,我国每年花生粕大多作为饲料,花生粕利用的附加值低,资源浪费严重[8-9]。因此研究花生粕资源的高值化利用具有重要意义。

目前国内外采用微生物发酵的方式来提高原料的利用率和质量,人们对微生物发酵技术的关注度日益提高[10-11],微生物发酵不仅可以改变发酵物的风味和质地,并且可以增加生物活性物质[12]。对于发酵方式而言,固态发酵的方式已从单菌发酵向混合菌发酵的方向发展[13]。混菌发酵过程中,不同微生物间具有互补性和协同性,使酶促反应更加全面,并且能同时得到多种生物活性物质[14]。纳豆芽孢杆菌具有多种功能性活性物质,其中的纳豆激酶具有降血栓,预防和治疗心脑血管疾病和降血脂等功能[15-17];红曲具有活血祛瘀、化浊降脂等功能,含有的γ-氨基丁酸具有明显的降血压的作用,并且是大脑的一种化学传递物质,可以调节大脑兴奋与抑制等作用[18-20]。但是目前利用纳豆芽孢杆菌和红曲霉混菌发酵的研究鲜有报道。

本研究以花生粕为原料,利用纳豆芽孢杆菌和红曲霉进行固态混菌发酵,以发酵物中纳豆激酶(NK)的活力和γ-氨基丁酸的(GABA)含量为指标,探究发酵温度、发酵时间、料水比、菌种比例(纳豆芽孢杆菌∶红曲霉)及接种量对发酵效果的影响,以确定最佳的发酵工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

纳豆芽孢杆菌 分离于日本高野纳豆,由青岛大学食品工程实验室保存;红曲霉 来自于青岛大学食品工程实验室保存的菌种;花生粕 由青岛嘉里植物油厂提供;干酪素、γ-氨基丁酸、氢氧化钠、硫酸铜、次氯酸钠、无水碳酸钠等试剂均为国产分析纯。

721G可见分光光度计 上海精密仪器有限公司;YXQ-LS-50SII灭菌锅 上海博迅实验有限公司;CR21GⅢ高速冷冻离心机 日本Hitachi有限公司;CHA-S恒温振荡器 常州国宇仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配制 纳豆芽孢杆菌液体培养基:蛋白胨1.0%,牛肉膏0.5%,氯化钠0.3%,葡萄糖1.0%,酵母膏0.5%;红曲霉液体培养基:牛肉膏3.0%,蛋白胨0.8%,硝酸钠0.8%,葡萄糖3.0%,硫酸镁0.1%,丙三醇7.0%;固态发酵培养基:花生粕(湿重)10 g,蔗糖0.15 g,硫酸镁0.021 g,磷酸氢二钾0.1 g,氯化钙0.027 g,水根据试验设计要求添加,121 ℃高压灭菌20 min。

1.2.2 种子液的制备 纳豆芽孢杆菌经斜面活化后刮入1～2环接入液体培养基中,37 ℃、160 r/min 的条件下振荡培养18 h作为发酵种子液,备用;红曲霉菌经过斜面活化后,加入5 mL蒸馏水,用无菌刮子将孢子轻轻挂下,按2%的比例接入装有50 mL培养基中于30 ℃,150 r/min摇床培养4～5 d,制成发酵种子液,备用。

1.2.3 工艺流程 花生粕固体培养基经高压灭菌后,冷却至室温。在无菌条件下,将纳豆芽孢杆菌种子液和红曲霉种子液按一定比例混合喷洒于培养基中搅拌均匀,纱布封口,发酵后,加入一定量的水,4 ℃浸提2 h,4000 r/min离心15 min,取上清液备用。

1.2.4 单因素实验 固定发酵条件:自然pH下,发酵温度为34 ℃,发酵时间为70 h,料水比(W/V)1∶0.5 g/mL,菌种比例(纳豆芽孢杆菌∶红曲霉)为1∶1,接种量为花生粕(湿重)的8%;依次改变发酵温度、发酵时间、料水比、菌种比例和接种量,考察各单因素对纳豆激酶活力与γ-氨基丁酸含量的影响。各因素研究的水平设置分别为:发酵温度:28、31、34、37、40 ℃;发酵时间:34、46、58、70、82、94 h;料水比:1∶0.2、1∶0.3、1∶0.4、1∶0.5、1∶0.6 g/mL;菌种比例(纳豆芽孢杆菌∶红曲霉):1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1;接种量:2%、4%、6%、8%、10%。

1.2.5 正交试验设计 根据单因素实验结果,选择温度、时间、料水比、菌种比例和接种量等影响较为显著的因素进行正交试验,实验设计见表1。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

1.2.6 测定方法

1.2.6.1 纳豆激酶活力(NK)的测定 采用Folin酚法[21-22]测定。酶活力单位的定义:温度为40 ℃,环境pH7.5的条件下,1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸的纳豆激酶量为一个酶活力单位,以1 U/g表示。

纳豆激酶活力计算公式:

其中:X为纳豆激酶的活力;A样为样品液的光吸收值OD680 nm;A对为对照液的光吸收值OD680 nm;K为标准曲线上光吸收值为1时的酪氨酸含量,μg;V为酶促反应的总体积,mL;T为酶促反应的时间,min;N为粗酶液的稀释倍数。

1.2.6.2γ-氨基丁酸(GABA)含量的测定 采用Berthelot比色法[23]进行测定。γ-氨基丁酸含量的计算公式:

其中:Y为花生粕中GABA含量,mg/g;m为样品液中GABA含量,mg/mL;r为样品液的总体积,mL;q为稀释倍数;M为花生粕的质量,g。

1.2.6.3 抗氧化活性的测定 羟自由基清除率[24]、DHHP[25]、铁还原力[26]等按照文献进行测定。

1.3 数据处理

采用Origin 8.0和Excel制图,SPSS 20.0对数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 酶活的标准曲线

纳豆激酶活力标准曲线见图1,回归方程为y=0.0072x-0.0029,R2=0.9987。

图1 纳豆激酶活力标准曲线Fig.1 Nattokinase activity standard curve

2.2 γ-氨基丁酸的标准曲线

γ-氨基丁酸的标准曲线见图2,回归方程为y=1.7296x+0.012,R2=0.9979。

图2 γ-氨基丁酸标准曲线Fig.2 γ-aminobutyric acid standard curve

2.3 单因素实验结果

2.3.1 发酵温度对发酵效果的影响 由图3可以看出,在28～40 ℃,NK先上升后下降的趋势,当发酵温度为34 ℃时达到最高;GABA也呈先上升后下降的趋势,34 ℃达到最高,这可能是因为菌种的生长对温度要求较高,特别是混合菌种,在适宜温度范围内,纳豆芽孢杆菌和红曲霉才能快速生长繁殖,产生大量的蛋白酶和γ-氨基丁酸。综合发酵温度对这2个指标的影响,确定31～37 ℃作为正交试验发酵温度范围。

图3 发酵温度对发酵效果的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on fermentation efficacy

2.3.2 发酵时间对发酵效果的影响 由图4可以看出,在34～94 h,NK先上升后下降的趋势,当发酵时间为58 h时达到最高,在发酵初期,纳豆芽孢杆菌大量生长繁殖,分泌的酶量多,随着发酵时间的延长,分泌量逐渐降低;GABA的发展趋势与NK相似,这可能是随着培养时间延长,菌种进入衰亡期,菌分泌的代谢产物逐渐减少。综合发酵时间对这2个指标的影响,确定46～70 h作为正交试验发酵时间范围。

图4 发酵时间对发酵效果的影响Fig.4 Effect of fermentation time on fermentation efficacy

2.3.3 料水比对发酵效果的影响 由图5可以看出,最适的料水比是1∶0.4 g/mL,在此条件下,NK活性和GABA含量均达到最大。固态发酵过程中水分是一个至关重要的因素,水分含量的高低影响着营养物质的溶解和培养基的透气性,从而影响菌种的生长。故选择1∶0.3～1∶0.5 g/mL作为正交试验的水平范围。

图5 料水比对发酵效果的影响Fig.5 Effect of material-waterratio on fermentation efficacy

2.3.4 菌种比例对发酵效果的影响 由图6可以看出,最适的菌种比例(纳豆芽孢杆菌∶红曲霉)是1∶1。菌种混合比例对花生粕发酵产物的影响较为明显。随着纳豆芽孢杆菌:红曲霉比例的增加,NK和GABA均呈现先增加后降低的趋势,纳豆芽孢杆菌∶红曲霉为1∶1时达到最高点。原因可能是无论哪种菌种比例多,对相互的生长有明显的抑制作用,影响了生物活性物的分泌。故选择菌种比例(纳豆芽孢杆菌∶红曲霉)1∶2～2∶1作为正交试验的水平范围。

图6 菌种比例对发酵效果的影响Fig.6 Effect of strain ratio on fermentation efficacy

2.3.5 接种量对发酵效果的影响 由图7显示可知,接种量在2%～10%的范围内,NK和GABA基本上都是先上升后下降的趋势,6%的接种量最高。随着接种量的增加,两种菌分泌的活性物较多,能较好的利用底物的营养物质,故所产生的发酵物慢慢增加,在达到6%之后,出现逐渐下降的趋势,可能是由于菌量的增加,消耗的营养物质较多,导致菌的生长受到了影响。综合该因素对纳豆激酶活力和γ-氨基丁酸含量的影响,选择4%～8%作为正交试验水平范围。

表2 正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal test design and results

图7 接种量对发酵效果的影响Fig.7 Effect of inoculum size on fermentation efficacy

2.4 正交试验的结果

在单因素实验基础上,设计L18(35)的正交试验,优化最佳发酵工艺参数组合。正交试验的结果如表2所示。

由表2可以看出,正交试验各因素对花生粕发酵物中纳豆激酶活力影响程度大小顺序依次为:温度>料水比>接种量>时间>菌种比例,得到的最佳工艺参数:A1B1C2D3E2,即温度31 ℃,时间46 h,料水比1∶0.4 g/mL,菌种比例(纳豆芽孢杆菌∶红曲霉)2∶1,接种量6%。对γ-氨基丁酸含量的影响程度大小顺序依次为:温度>时间>菌种比例>接种量>料水比,得到的最佳工艺参数是:A2B1C2D1E1,即温度34 ℃,时间46 h,料水比1∶0.4 g/mL,菌种比例(纳豆芽孢杆菌∶红曲霉)1∶2,接种量4%。

由表2可知,以发酵花生粕中纳豆激酶活力和γ-氨基丁酸含量为指标,进行正交试验得到的最佳工艺参数有所不同,各个指标的各个因素具有不同的影响程度。综合考虑单因素实验、正交试验结果及经济性等方面,主要以纳豆激酶活性为主要参考指标。通过分析,时间为46 h和料水比为1∶0.4 g/mL对于两个指标都是最佳的水平,其他的指标以纳豆激酶活性为主要参考,温度31 ℃,菌种比例(纳豆芽孢杆菌∶红曲霉)2∶1,接种量6%作为指标的最佳水平,即A1B1C2D3E2。由于筛选出的最佳组合不在实验设计中,需要做实验进行验证。

将A1B1C2D3E2进行三次平行验证,得到发酵液中NK的活力为(844.56±13.80)U/g,GABA含量为(105.25±0.25) mg/g,此结果优于其他试验的结果,原因为对于NK的活力而言A1B1C2D3E2组合中发酵时间短,菌种比例中纳豆芽孢杆菌所占的比例较多,多种因素综合起来有利于NK的活力;另外通过正交试验分析温度在31和34 ℃下GABA含量均高,而A1B1C2D3E2和A2B1C2D3E1中时间、料水比和菌种比例均相同,所以测得GABA的含量相差不大。因此A1B1C2D3E2为最佳的工艺条件,即温度31 ℃,时间46 h,料水比1∶0.4 g/mL,菌种比例(纳豆芽孢杆菌∶红曲霉)2∶1,接种量6%。在此条件下对羟自由基清除率为68.46%±0.16%,对DPPH·清除率为76.98%±0.95%,铁还原力的OD值为0.481。

3 结论

以发酵花生粕中的纳豆激酶活力和γ-氨基丁酸的含量为指标,通过单因素实验和正交试验,优化纳豆芽孢杆菌和红曲霉混合菌固体发酵花生粕的工艺参数为:温度31 ℃,时间46 h,料水比1∶0.4 g/mL,菌种比例(纳豆芽孢杆菌∶红曲霉)2∶1,接种量6%,测得NK的活力为(844.56±13.80) U/g,GABA含量为(105.25±0.25) mg/g,对羟自由基清除率为68.46%±0.16%,对DPPH·清除率为76.98%±0.95%,铁还原力的OD值为0.481。

利用纳豆芽孢杆菌和红曲霉混菌发酵花生粕,不仅能获得纳豆激酶,还可以得到γ-氨基丁酸、抗氧化肽等功能性的生物活性物,提高花生粕的附加值,为花生产业的发展提供了新的思路。