CHO-K1细胞的悬浮驯化及无血清培养

刘华敏，漆彦斌，雷志斌

（广东顺德工业设计研究院，广东 佛山 528300）

CHO 细胞，即中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cells），具有不死性，可以传代培养上百代，是生物技术药物研发重要的工程抗体和重组蛋白的表达系统［1］，也是工业大规模化生产中最常见的细胞株，被广泛作为外源基因的宿主生产蛋白药物［2］。其优点在于，具有转录后准确的修饰功能，表达的糖基化蛋白在分子结构和生物学功能方面最接近天然分子蛋白［3-4］；属于成纤维细胞，细胞内源蛋白表达低，表达产物直接分泌到培养基中，便于收集目标表达产物［5］。

传统的CHO 细胞培养方式是在含有血清的培养基中贴壁生长，血清在给细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质的同时，由于其所含成分复杂［6］，且不同产地、批次之间存在着质量差异，因而给动物细胞大规模培养工艺造成了诸多不利影响。又因细胞培养获得产物的过程中，血清成为分离和纯化的主要障碍，因此，无血清培养基已成为哺乳动物细胞培养技术的发展方向［7］。

在工业化大规模生产中，细胞悬浮培养明显优于单层培养，是哺乳动物细胞首选模式［8］。CHO 细胞可以在无血清培养基中悬浮培养，适合工业化大规模培养。目前国内的CHO 细胞化学成分限定的无蛋白培养基主要依赖Invitrogen、Sigma、Hyclone、Longza等国外试剂公司。当前针对CHO 细胞无血清培养基的研究，主要方法是在基础培养基如DMEM/F12的基础上，添加蛋白水解物，胰岛素、转铁蛋白、生长因子、维生素、脂类、微量元素等［3，9-10］，这些都在一定程度上含有动物来源的蛋白或植物蛋白水解物，给生物制药带来风险。随着人们对生物制品安全性要求的提高，无血清培养基，甚至化学成分限定的无蛋白培养基已逐渐成为今后发展的必然趋势。因此，开发CHO 细胞化学成分限定的无血清培养基具有重要意义。

本文以CHO-K1细胞为研究对象，首先对贴壁细胞进行了悬浮驯化，之后在相同实验条件下，统计三种培养基中细胞的增长率和存活率，比较了自配无血清培养基、Sigma Ex-CELL CD CHO 培养基和Gibco CD CHO 培养基驯化悬浮细胞CHO-K1-S 的培养效果，开发出适合CHO 细胞生长的低成本化学成分限定的无血清培养基。

1 材料与方法

1.1 材料

1）细胞株。中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1）购自ATCC。

2）培养基。Ex-CELL CD CHO 购自美国Sigma公司；CD-CHO 购自美国 Gibco 公司；DMEM、F12和RPMI1640购自美国Corning 公司。

3）试剂。ITS 购自美国Sigma 公司；PBS 购自美国Corning 公司；FBS 购自美国 Gibco 公司。

1.2 方法

1）培养基的配置。将DMEM、F12和RPMI1640按照2∶1∶1的比例进行混合，混匀后，以此为基础培养基，添加ITS 配置成无血清培养基，将自配无血清培养基命名为CHO-SFM。

2）细胞的悬浮驯化。取对数生长期的CHO-K1贴壁细胞，采用逐步降血清法将含10% FBS 的F12培养基逐步替换为8%、5%、3%、2%、1%、0.5%FBS 的F12培养基进行适应培养，每个血清浓度传代培养15～20次，使细胞在各血清浓度培养基里适应生长。

取适应0.5% FBS 的F12低血清培养基培养条件的CHO-K1贴壁细胞，以5×105cells/mL 的密度接种到125 mL 的三角细胞摇瓶中，逐步加入含有50%、70%、80%、90%、100% Sigma Ex-CELL CD CHO 细胞培养基，37 ℃，5% CO2，100 rpm 条件下进行培养液的逐步替代培养。

3）悬浮细胞的培养。CHO-K1悬浮细胞的传代培养：收集处于对数生长期的CHO-K1悬浮细胞，将细胞悬浮液收集到50 mL 无菌离心管中，800 rpm离心10 min，弃上清，加入新鲜的无血清培养基，轻轻吹散细胞团重悬细胞，以5×105cells/mL 的密度接种到125 mL 的三角细胞摇瓶中。将接种好细胞的摇瓶放入37 ℃，5% CO2，100 rpm 条件下的摇床培养箱中进行培养。

4）细胞密度和细胞存活率。分别用CHOSFM、Ex-CELL CD CHO 和CD-CHO 三种无血清培养基对正常传代的CHO-K1悬浮细胞进行接种培养，连续培养7天，用倒置相差显微镜观察细胞形态，每24 h 进行一次细胞计数和存活率的统计。

用全自动细胞计数仪CountStar 检测细胞密度。采用台盼蓝染色法计细胞活率，用血球计数板计数，测定细胞的存活率。以细胞培养天数为横坐标轴，以细胞密度和细胞活率为纵坐标轴绘制细胞生长和存活率曲线。

2 结果

2.1 贴壁细胞的低血清适应培养

显微镜观察适应各血清浓度CHO-K1细胞的生长状况，细胞形态较一致，呈不规则多边形，紧密排列，细胞生长速度快，增殖能力强，为典型的上皮细胞系。当血清少于1%时，细胞形态由多边形变成长梭形，但经多次传代适应培养，最终趋于正常，如图1所示。

图1 CHO-K1细胞在FBS 浓度为0.5%培养基中的生长状态（×100）

2.2 三种培养基的悬浮培养

CHO-K1细胞在驯化之前细胞贴壁生长，呈梭形。经过Ex-CELL CD CHO 无血清培养基驯化后获得的无血清悬浮型CHO-K1-S 细胞呈球形，分散性好，细胞透亮，存活率高，生长状态好，如图2所示，说明成功完成了贴壁细胞的悬浮驯化。

图2 CHO-K1-S 悬浮细胞的生长状态（×100）

每天观察CHO-SFM、Ex-CELL CD CHO 和CDCHO 三种无血清培养基培养CHO-K1-S 悬浮细胞的生长状况和形态。倒置显微镜下可看到细胞均呈圆形，大小一致，均匀分散在培养基中。证明三种无血清培养基都能够满足CHO-K1-S 悬浮细胞的生长需求。细胞计数结果显示，接种细胞第4天，细胞密度达到高峰，其中CHO-SFM 培养的细胞密度最高，达到6×106cells/mL。Ex-CELL CD CHO 和CD-CHO无血清培养基培养细胞密度分别为5.5×106cells/mL和5×106cells/mL，见图3。细胞培养前4 d 细胞培养基能够基本满足细胞营养需求，细胞活率均保持在95%以上，三种培养基差别不大。培养至5～7 d 细胞活率逐渐下降，可能是由于后期营养的消耗以及代谢废物的积累导致，见图4。综合以上结果说明，CHO-K1-S 悬浮细胞在自配无血清培养基CHO-SFM中的生长情况优于其它两种进口培养基；Ex-CELL CD CHO 无血清略优于CD-CHO 的无血清培养基。

图3 三种无血清培养基中的细胞生长密度

图4 三种无血清培养基中的细胞存活率

3 讨论

CHO-K1贴壁细胞从有血清到低血清培养，在含1% FBS 培养基培养的时候出现细胞呈拉长状态，细胞生长减缓的现象，可能是因为低血清导致细胞代谢转换的原因。经多次传代适应低血清培养，细胞逐渐恢复至原来的状态。表明在长时间逐步降血清适应过程中，细胞通过调整代谢途径，维持细胞活性［11］。在悬浮培养过程中，易出现细胞死亡和结团现象［12］，本实验采用长期适应驯化，通过传代丢弃死亡和结团细胞的数量，逐步筛选出适合悬浮生长的细胞CHO-K1-S。

本研究中，在相同实验条件下，Ex-CELL CDCHO 无血清培养基培养的细胞密度略多于CD-CHO的无血清培养基可能是因为悬浮驯化培养时选用了Ex-CELL CD-CHO，实验过程中细胞在该培养基中不用经历换用培养基的适应过程，更适合CHO-K1-S细胞的悬浮培养。但是自配无血清培养基CHO-SFM中的细胞密度始终高于Ex-CELL CD-CHO 无血清培养基，说明自配无血清培养基CHO-SFM 在克服了换用培养基的适应过程中导致细胞生产迟滞的同时，给予悬浮细胞更充足的营养，更适合细胞的细胞增殖生长。

4 结论

本实验采用长期适应驯化将CHO-K1贴壁细胞成功驯化成悬浮细胞CHO-K1-S，该悬浮细胞呈圆形，大小一致，均匀分散在培养基中，细胞密度可达106cells/mL。自配无血清培养基在培养CHOK1-S 悬浮细胞时优于两种进口培养基；Ex-CELL CD CHO 无血清略优于CD-CHO 的无血清培养基。开发出适合CHO-K1细胞生长的低成本无血清培养基。