前列腺癌组织中SKP2、Kindlin-2的表达变化及意义

张正林，蒋银锋，朱喜山

(常州市第三人民医院，江苏常州 213001)

前列腺癌是全球范围内男性常见恶性肿瘤。2016年美国约有18.1万新发病例，而死亡患者的病例高达2.6万例[1]。近年来随着诊断技术的发展，我国前列腺癌的发病率和病死率逐年增加，危害我国老年男性的身体健康。早期局限性前列腺癌可通过根治性手术、放疗等达到较好的治疗效果，但晚期转移性前列腺癌及去势抵抗前列腺癌患者预后较差[2]。S期激酶相关蛋白2(SKP2)基因位于人类染色体5p13.2，SKP2基因编码11个外显子，该基因编码蛋白特征是具有约40个氨基酸的F-box基序，是构成泛素连接酶复合物的四个亚基之一，在蛋白泛素化中发挥作用[3]。SKP2蛋白能特异性识别S期的磷酸化细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B(CDKN1B，亦称p27或KIP1)，并相互作用，参与细胞周期的调节[4]。近年来，SKP2基因被认为是一种原癌基因，参与肺癌[5]、结直肠癌[6]等多种肿瘤的发生发展。黏着斑蛋白-2(Kindlin-2)基因又称Fermt2，位于人类13号染色体，其编码的Kindlin-2蛋白是黏附分子蛋白的家族成员之一，能被细胞外的整合素信号活化，影响正常细胞的分化、增殖及肿瘤细胞的迁移、侵袭和凋亡等生物学行为[7,8]。刘畅等[9]研究结果显示，前列腺癌组织中SKP2、Kindlin-2蛋白表达异常，与患者较高的肿瘤分期有关。但目前有关SKP2及Kindlin-2在前列腺癌中的作用机制及临床价值报道较少。2013年2月～2019年2月，我们通过比较前列腺癌患者癌组织与前列腺增生(BPH)组织中SKP2和Kindlin-2 mRNA表达差异，分析两者表达的相关性及与前列腺癌患者临床病理特征和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年2月～2016 年2月就诊于我院并行手术治疗的90例前列腺癌患者(PCa组)的临床病理资料。前列腺癌患者为初次诊断，既往未接受抗肿瘤、放化疗等其他治疗，并排除其他系统的恶性肿瘤。患者年龄52～76(62.4±6.5)岁。前列腺癌病理分级参考Gleason评分系统，Gleason评分系统和肿瘤临床分期均参考《中国泌尿外科疾病诊断治疗指南》中相关标准[10]。其中Gleason评分≤6分者39例，Gleason评分≥7分者51例。肿瘤临床分期：Ⅰ～Ⅱ期 52例，Ⅲ～Ⅳ期38例。患者初始血清PSA：7.9～145 ng/mL，中位PSA为43.5 ng/mL，其中≤20 ng/mL者37例，>20 ng/mL者53例。入院后所有患者行核素骨扫描、核磁共振等检查，其中远处转移28例，无远处转移62例。患者术后均获得随访，随访时间2～48个月，中位随访时间34.6个月，随访方式为门诊复查或电话随访，复查内容主要包括患者生存状况、有无复发等，随访终点为随访时间的结束或患者死亡，截止时间为2019年2月1日。选取同期行耻骨上前列腺摘除术的40例BPH患者BPH组织标本(BPH组)，年龄54～78(67.5±6.8)岁。本研究经我院伦理委员会批准通过，所有患者及家属知情同意并签字。

1.2 前列腺癌组织及BPH组织中SKP2和Kindlin-2表达检测 采用荧光实时定量PCR法检测。收集术中离体2 h内获取的组织标本，-80 ℃冰箱长期保存。取约100 mg标本组织，研钵研碎后，加1 mL的TRIzol液，按RNA提取试剂盒说明书提取组织中总RNA，分光光度计检测提取RNA的浓度和纯度。按照逆转录试剂盒说明书(购自大连宝生物公司)进行逆转录合成cDNA。取2 μL模板用于qRT-PCR反应。SKP2正向引物：5′-ATGCCCCAATCTTGTCCATCT-3′，反向引物：5′-CACCGACTGAGTGATAGGTGT-3′；Kindlin-2正向引物：5′-TGGACGGGATAAGGATGCCA-3′，反向引物：5′-GACATCACGGTTCAGGTCCG-3′；内参GAPDH正向引物:5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，反向引物:3′-GCCATCACGCCACAGTTTC-5′。PCR总反应体系为20 μL，包括cDNA溶液2 μL，正向及反向引物各0.5 μL，2×SYBR Green Master Mix试剂12.5 μL、去离子纯水4.5 μL。PCR反应条件：95 ℃ 变性5 min，95 ℃ 70 s、50 ℃ 延伸30 s，共40个循环。目的基因SKP2或Kindlin-2相对表达量以2-ΔΔCt值计算。

2 结果

2.1 前列腺癌组织及BPH组织中SKP2、Kindlin-2 mRNA表达及二者间的相关性 前列腺癌组织中SKP2的相对表达量为2.68±0.45，BPH组织中为0.94±0.28，前列腺癌组织中SKP2的相对表达量高于BPH组织中(t=22.563，P=0.000)；前列腺癌组织中Kindlin-2的相对表达量为1.42±0.43，BPH组织中为0.84±0.21，前列腺癌组织中Kindlin-2的相对表达量高于BPH组织中(t=8.100，P=0.000)。前列腺癌组织中SKP2与Kindlin-2的表达呈正相关(r=0.617，P=0.003)。

2.2 前列腺癌组织中SKP2、Kindlin-2表达与患者临床病理特征的关系 前列腺癌组织中SKP2、Kindlin-2表达与病理Gleason评分和肿瘤TNM分期有关(P均<0.05)，而与患者年龄、初始PSA水平及是否远处转移无关(P均>0.05)。Gleason评分≥7分、Ⅲ～Ⅳ期前列腺癌患者癌组织中SKP2、Kindlin-2表达高于Gleason评分≤6分、Ⅰ～Ⅱ期患者(P均<0.05)，见表1。

表1 前列腺癌组织中SKP2、Kindlin-2表达与患者临床病理特征的关系

2.3 前列腺癌组织中SKP2、Kindlin-2表达与患者预后关系 PCa组SKP2相对表达量以平均值2.68为临界值，分为SKP2高表达组43例，SKP2低表达组47例。SKP2高表达组、SKP2低表达组3年生存率分别为65.1%(28/43)、85.1%(40/47)，Kaplan-Meier分析(Log-rank检验)结果显示，SKP2高表达组3年生存率低于SKP2低表达组(χ2=3.516，P=0.032)。以Kindlin-2相对表达量平均值1.42为临界值，分为Kindlin-2高表达组46例，Kindlin-2低表达组44例，Kindlin-2高表达组、Kindlin-2低表达组3年生存率分别为58.6%(27/46)、93.1%(41/44)，Kaplan-Meier分析(Log-rank检验)结果显示，Kindlin-2高表达组3年生存率低于Kindlin-2低表达组(χ2=3.966，P=0.046)，见图1。

图1 Kaplan-Meier分析不同SKP2、Kindlin-2表达前列腺癌患者的生存曲线

3 讨论

亚洲男性前列腺癌的发病率低于欧美国家，但近年呈现上升趋势，且增长速度比欧美发达国家更迅速。目前前列腺癌的治疗包括观察等待、根治性手术、根治性放疗、内分泌治疗及化疗等，治疗方案的选择主要依据患者年龄、一般状况、预期寿命、Gleason评分及是否伴有远处转移等因素决定。但由于肿瘤的异质性及基因组的不稳定性，部分患者可出现术后复发和远处转移等，预后较差[11]。因此，深入研究前列腺癌发生发展的机制，对于早期诊断、治疗方式选择及预后判断有重要临床意义。

SKP2作为一种F-box家族蛋白之一，是泛素连接酶复合物的底物识别亚基。研究表明，SKP2参与细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)抑制物p27(Kip1)的泛素依赖性降解，参与细胞有丝分裂过程中G2期的调节，在乳腺癌等多种肿瘤中均存在异常表达升高的现象，促进肿瘤细胞的增殖，并抑制凋亡[12]。本研究中，前列腺癌组织中SKP2表达上调,其机制尚不清楚，可能与调控SKP2表达的微小RNA(miR)339等表达降低有关[13]，有研究报道，非小细胞肺癌中miR-339表达降低，导致结合于SKP2信使RNA3′端非翻译区减少，其抑制SKP2基因表达能力下降，SKP2表达增加[14]。此外,本研究中Gleason评分≥7分、Ⅲ～Ⅳ期前列腺癌患者癌组织中SKP2表达高于Gleason评分≤6分、Ⅰ～Ⅱ期患者，差异有统计学意义，表明SKP2参与肿瘤发展。其原因一方面是SKP2表达增加能通过抑制Cdk抑制物，促进肿瘤细胞周期的发展，肿瘤细胞G1/S期比例升高，导致肿瘤分期增高。另一方面，SKP2能促进上皮间质转化过程中的关键转录因子Twist表达，导致肿瘤细胞发生上皮间质转化，细胞异型性增加，Gleason评分升高[15]。本研究进一步分析不同SKP2表达水平患者3年生存率的差异，结果高SKP2表达患者3年生存率明显降低。表明SKP2有可能成为新的提示前列腺癌预后的分子生物学标志物。

Kindlins家族成员是共同含有FERM结构域的蛋白质分子，含有FERM结构域蛋白的典型F1、F2和F3亚结构域。哺乳动物中有三种Kindlin家族成员，分别为Kindlin-1、Kindlin-2和Kindlin-3，三者高度同源，约60%的氨基酸序列相同。Kindlins-2能被细胞外基质的整合素配体结合活化整合素信号通路，进而活化下游信号通路促进细胞黏附、扩散和迁移[16]。近年来研究表明，Kindlin-2能通过Kindlin-2/TGF-β/CSF-1信号轴，促进肿瘤相关巨噬细胞的活化，促进肿瘤细胞的增殖[17]。本研究中，前列腺癌组织中Kindlin-2表达上调，其原因可能是调控其表达的长链非编码RNA(LncRNA)ATB升高后，作为分子海绵结合并促进Kindlin-2表达，促进肿瘤细胞的增殖及迁移能力，促进肿瘤的发展[18]。本研究中，Kindlin-2基因的表达与较高的Gleason评分和TNM分期有关，表明Kindlin-2参与前列腺癌的发生发展。其机制是Kindlin-2表达能直接促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，促进肿瘤浸润及远处转移，促进肿瘤的恶性进展[19]。本研究中，Kindlin-2高表达患者生存预后较差，与以往研究报道一致[20]，表明Kindlin-2亦可能成为前列腺癌预后的分子标志。

本研究中，前列腺癌组织中SKP2与Kindlin-2表达呈正相关，目前两者相互作用的机制尚不清楚，可能与两者共同参与Wnt信号通路的调控有关。SKP2表达升高通过泛素化降解p27，促进β-钙黏素进入细胞核，激活Wnt信号传导通路[21]，而Kindlin-2表达亦能同时促进Wnt/β-catenin信号通路的活化[22]，二者协同促进下游靶基因如癌基因c-Myc、Smad7的表达，促进肿瘤的发生发展。

综上所述，前列腺癌组织中SKP2及Kindlin-2均表达升高，二者联合检测有助于前列腺癌患者的病情判断及预后评估。