膀胱癌组织中PVRL4、NF-κB p65、E-cadherin的表达变化及意义

杜刚，黄瑛

(1中国医科大学第二临床学院，沈阳110004；2鞍钢集团公司总医院)

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。最新报道显示，目前我国膀胱癌总体发病率约为7.49/10万，其中男性发病率约为11.41/10万，女性发病率约为3.81/10万，发病率呈逐年升高趋势[1]。目前，膀胱癌的病因和发病机制仍未完全明确，相关研究表明，膀胱癌是一种多基因相关的恶性肿瘤，其发生发展与多种癌基因激活及抑癌基因失活有关[2]。脊髓灰质炎病毒受体相关基因4(PVRL4)是近年来新发现的一种癌基因，其表达产物具有调节上皮黏着连接形成的作用[3]。目前已有报道表明，在乳腺癌、肺癌中存在PVRL4高表达，但在膀胱癌中表达情况报道较少[4,5]。NF-κB信号通路是细胞内重要的信号调节通路，NF-κB p65是重要的转录调节因子，本课题组前期研究发现，NF-κB p65与膀胱炎有密切关系，可能对膀胱癌诊断和预后判定有一定价值[6]。E-钙黏素(E-cadherin)是一种重要的黏附分子，与膀胱癌发生发展有关[7]。2017年3月～2018年10月，我们观察了PVRL4、NF-κB和E-cadherin在膀胱癌组织中的表达变化，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年1月～2018年4月大连医科大学附属第一医院手术切除的46例份膀胱癌组织及其相应癌旁组织(距离肿瘤组织2 cm)石蜡标本。纳入标准：①患者均经病理检查确诊为膀胱癌；②患者初次发病，病历资料齐全；③术前未经放疗、化疗等；④患者及家属对研究知情同意，并签署知情同意书。其中男34例、女12例，年龄54～86(62.37±6.83)岁。单发17例，多发29例；肿瘤直径：≤2 cm 32例，>2 cm 14例； 病理分级：Ⅰ级11例、Ⅱ级19例、Ⅲ级16例；临床分级：Ta～T1 18例，T2～T4 28例。有淋巴结转移11例，无淋巴结转移35例。标本均经甲醛固定，石蜡包埋，制成4 μm厚连续切片，本研究经医院伦理委员会研究同意。

1.2 膀胱癌组织及其癌旁组织中PVRL4、NF-κB p65和E-cadherin表达检测 应用免疫组化SP法对膀胱癌组织及其癌旁组织中PVRL4、NF-κB p65和E-cadherin表达进行检测，免疫组化SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，NF-κB p65和E-cadherin兔抗人多克隆抗体购自武汉博士德有限公司，PVRL4兔抗人单克隆抗体购自美国Abcam公司。石蜡切片经过脱蜡，梯度乙醇水化、PBS缓冲液冲洗、3%过氧化氢甲醇消化内源性过氧化物酶、高温抗原修复、加入山羊血清进行封闭、滴加生物学一抗、生物学二抗、辣根过氧化物酶-链霉素工作液、TTBS冲洗、DAB显色、苏木素复染、制片封闭等。以说明书提供样本作为阳性对照，以PBS代替生物学一抗作为阴性对照。参照文献[8]方法对结果进行判定，采用双盲法由两名资深病理科医生诊断。PVRL4 、NF-κB p65位于细胞质或细胞核内，当细胞质或细胞核内出现黄色或棕黄色颗粒为PVRL4 蛋白阳性；E-cadherin位于细胞质和细胞膜上，当细胞质和细胞膜出现黄色或棕黄色颗粒为E-cadherin阳性。每张切片随机选取5个高倍镜视野倒置显微镜下(×400)观察，根据染色强度和阳性细胞所占比例赋分：未着色(0分)、浅黄色(1分)、棕黄色(2分)、黄褐色(3分)；无阳性细胞(0分)、阳性细胞所占比例1 % ～ 25 %(1分)、阳性细胞所占比例26 % ～ 50 %(2分)、阳性细胞所占比例51 % ～ 75 %(3分)、阳性细胞所占比例76 % ～ 100 %(4分)；总分=染色强度评分×阳性细胞所占比例率评分，总分≤ 6分计为阴性，> 6分计为阳性。

2 结果

2.1 膀胱癌组织和癌旁组织中PVRL4、NF-κB p65和E-cadherin表达比较 膀胱癌组织中 PVRL4、NF-κB p65、E-cadherin阳性表达率分别为73.91%(34/46)、78.26%(36/46)、13.04%(6/46)，相应癌旁组织中PVRL4、NF-κB p65、E-cadherin阳性表达率分别为15.22%(7/46)、26.09%(12/46)、63.04%(2/46)，膀胱癌组织中 PVRL4和NF-κB p65阳性表达率高于癌旁组织(P均<0.05)，E-cadherin阳性表达率低于癌旁组织(P<0.05)。

2.2 PVRL4、NF-κB p65和E-cadherin表达与膀胱癌患者临床病理特征的关系 膀胱癌组织中PVRL4、NF-κB p65和E-cadherin阳性表达率与患者性别、年龄、肿瘤数目、肿瘤直径无关(P均﹥0.05)，与病理分级、临床分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)，随病理分级、临床分期升高，PVRL4、NF-κB p65阳性表达率升高，E-cadherin阳性表达率降低，有淋巴结转移者PVRL4、NF-κB p65阳性表达率高于无淋巴结转移者，E-cadherin阳性表达率低于无淋巴结转移者(P<0.05)，见表1。

表1 PVRL4、NF-κB p65和E-cadherin表达与膀胱癌患者临床病理特征的关系[例(%)]

2.3 膀胱癌组织中PVRL4、NF-κB p65和E-cadherin表达的相关性 Spearman相关分析显示，PVRL4表达与膀胱癌病理分级、临床分期、淋巴结转移呈正相关(r分别为0.753、0.802、0.821，P均<0.05)；NF-κB p65表达与膀胱癌病理分级、临床分期、淋巴结转移呈正相关(r分别为0.761、0.813、0.832，P均<0.05)；E-cadherin表达与膀胱癌病理分级、临床分期、淋巴结转移呈负相关(r分别为-0.674、-0.756、-0.839，P均<0.05)。膀胱癌组织中PVRL4与NF-κB p65表达呈正相关(r分别为0.847、0.852、P均<0.05)，与E-cadherin表达呈负相关(r=-0.759,P<0.05)。

3 讨论

大量临床研究表明，膀胱癌的发生发展过程复杂，涉及到：①抑癌基因突变及缺失；②癌基因激活及过度表达；③细胞端粒酶过度表达；④调控信号传导通路的功能紊乱；⑤在基因组中出现核苷酸异常的串联重复，微卫星不稳定；⑥与修复功能相关的基因功能丧失。研究膀胱癌基因的表达对于提高膀胱癌的临床诊断，寻找分子靶向治疗的新方法有重要意义。

PVRL4是近年来新发现的一种癌基因，其编码的PVRL4蛋白是一个含有510个氨基酸的跨膜蛋白，相对分子质量为66 kD[9]。研究表明，PVRL4蛋白属于免疫球蛋白超家族Nectin的成员，与细胞增殖、黏附和迁移等有密切关系[10]。Raza等[11]研究报道，PVRL4蛋白主要在人胚胎发育阶段和肿瘤组织中表达，而在正常成人组织中不表达。近年来有学者发现，PVRL4是肺癌、乳腺癌和卵巢癌的肿瘤细胞标志物蛋白[12,13]。NF-κB是一个转录因子家族，主要包括Rel、RelB 、NF-κB p50、NF-κB p52、NF-κB p65 5个成员，生理状态下NF-κB主要以p65/p50异源二聚体的形式存在于细胞内，并与其抑制蛋白相结合，在细胞质内处于非活性状态[14]。当机体处于应激、炎症、创伤和肿瘤时，NF-κB抑制蛋白被磷酸化，使p65/p50异源二聚体解离，并与相应的位点特异性结合，启动信号通路，发挥相应的功能。宫雪等[15]报道，NF-κB p65在膀胱癌组织中高表达，具有促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的作用。E-cadherin蛋白是钙黏素家族的重要成员，是由720～750个氨基酸构成的单链I型跨膜糖蛋白[16]。E-cadherin蛋白主要位于细胞连接处的细胞表面，在维持细胞间黏附、细胞极性及正常组织结构中起到重要作用。目前研究表明，E-cadherin表达下调可致细胞间连接改变，与上皮来源的恶性肿瘤发生有密切关系[17]。

本研究结果显示，膀胱癌组织中PVRL4和NF-κB p65阳性表达率高于癌旁组织，差异有统计学意义，E-cadherin阳性表达率低于癌旁组织，差异有统计学意义，与毛冲舟等[18]报道相符，证实在膀胱癌组织中存在PVRL4、NF-κB p65、E-cadherin异常表达，表明PVRL4、NF-κB p65、E-cadherin与膀胱癌的发生有密切关系。进一步分析发现，PVRL4、NF-κB p65表达与膀胱癌患者病理分级、临床分期、淋巴结转移呈正相关，E-cadherin表达与膀胱癌患者病理分级、临床分期、淋巴结转移呈负相关。推测其原因主要是：①PVRL4表达异常使膀胱上皮细胞失去稳定性，促进膀胱癌的发生[19]；②在各种致瘤因素下，p65/p50异源二聚体解离，NF-κB p65表达升高，NF-κB信号异常激活，促进肿瘤的进一步发展[20]；③E-cadherin表达下调导致细胞间连接降低，膀胱上皮细胞发生癌变，促进癌细胞转移[21]。可见，临床可通过检测PVRL4、NF-κB p65、E-cadherin表达来为膀胱癌诊断、疾病评估和预后判断提供辅助依据。

目前，对膀胱癌发生相关的分子机制仍未完全明确。本研究结果显示，膀胱癌中PVRL4与NF-κB p65表达呈正相关，与E-cadherin表达呈负相关。其中NF-κB p65是NF-κB信号通路的重要成员，而E-cadherin亦是NF-κB信号通路中的重要效应分子。有研究显示，NF-κB信号通路可调控E-cadherin，导致E-cadherin水平降低[22]。PVRL4与细胞增殖、黏附和迁移等密切相关。笔者推测PVRL4、NF-κB p65、E-cadherin可能共同参与膀胱癌的发生发展，其确切机制有待进一步研究证实。

综上所述，膀胱癌组织中PVRL4、NF-κB p65呈高表达，E-cadherin呈低表达，PVRL4、NF-κB p65、E-cadherin与膀胱癌患者病理分级、临床分期、淋巴结转移有关；三者可能共同参与膀胱癌的发生发展。