基于网络药理学三芪口服液治疗糖尿病肾病的作用机制

林嘉荣 张 蕾 桂定坤 曾贵兴 吴禹池 邹 川 林启展

1.广州中医药大学第二临床医学院，广东广州 510405；2.广州中医药大学第二附属医院肾内科，广东广州 510120；3.上海交通大学附属第六人民医院肾内科，上海 200233

据流行病学研究，我国慢性肾脏病发病率约10.8%[1]，而慢性肾脏病最终发展为肾终末期疾病（ESRD），已经成为我国严重的公共卫生事业问题。在我国，糖尿病肾病作为继慢性肾小球疾病之后慢性肾脏病的第二大病因[2]，且近年有升高趋势。在西方国家，糖尿病肾病已成为导致ESRD 的第一大病因[3]。因此，防治糖尿病肾病的重要性不言而喻。国医大师张琪教授认为，糖尿病肾病病机以本虚标实为特点，包含气阴两虚、脾肾气虚，脾肾虚衰三个主证及夹血瘀、夹湿浊、晚期以湿浊毒瘀血壅结三个兼证[4]。张再康等[5]根据多年临床经验，认为糖尿病肾病气虚血瘀病机贯穿病程始终，根据益气活血理论防治糖尿病肾病的临床实践，以三七、黄芪为主要成分开发的三芪口服液取得了良好的临床疗效，但其机制尚不明确。目前针对中药复方有效成分及作用机制主要通过动物实验、细胞实验等方法进行，但由于中药复方活性成分复杂，其作用机制研究存在一定的困难。随着科技的发展及化合物研究的兴起，网络药理学为复杂的中药系统研究提供了新的思路及方法。本研究运用网络药理学的方法，对三芪口服液的活性成分及作用靶点进行预测分析，探讨其治疗糖尿病肾病的作用机制，为三芪口服液的作用机制研究提供实验基础及理论研究。

1 材料与方法

1.1 材料

TCMSP 数据库、DrugBank 数据库、String 数据库、GeneCards 数据库、OMIM 数据库、DisGeNET 数据库；DAVID 6.8 数据库；KEGG 数据库；Cytoscape 3.2.1 软件。

1.2 药物分子信息收集及活性成分筛选

在TCMSP 数据库中检索得到三七和黄芪的药物动力学（ADME）参数信息，将生物利用度（OB）和类药性（DL）作为筛选指标，其筛选阈值均为OB ≥30%，DL ≥0.18[6]，筛选出三芪口服液中的活性成分。

1.3 三芪口服液潜在作用靶点预测

基于筛选的活性成分预测化合物潜在的靶点，经DrugBank 数据库将测出的靶点，以基因简称命名。

1.4 糖尿病肾病相关靶点构建

本研究基于GeneCards 数据库、OMIM 数据库、DisGeNET 数据库构建糖尿病肾病的相关靶点。Gene-Cards 数据库整合了约125 个网络来源的基因数据（包括基因组、转录组学、蛋白质组学等）；OMIM 数据库通过对新的病症分类并命名、收录表型和相关病因基因的关系来收录人类孟德尔疾病信息；DisGeNET是目前可用的最大和最全面的人类基因-疾病协会（GDAs）存储库之一，旨在解决有关人类疾病遗传基础的各种问题。以“Diabetic nephropathy”为检索词，在三大数据库中检索其疾病相关基因。最后合并三大数据库检索到的基因靶点，剔除重复值取其并集，完成糖尿病肾病相关靶点的构建。Venny 2.1.0 工具可以将三大数据库得到的疾病靶点与药物作用的靶点进行筛选，从而得出两者之间的重复靶点，即得出药物治疗疾病的靶点。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）全局网络构建

将糖尿病肾病相关靶点与三芪口服液潜在靶点导入String 蛋白质互作数据库，进行PPI 分析，利用Cytoscape3.2.1 构建靶点-靶点PPI 网络。设置网络中节点大小和颜色深浅反映度的大小，边的粗细反映连接度的大小，通过构建这一网络分析三芪口服液的作用机制。

1.6 潜在靶点生物学过程分析及通路富集

将三芪口服液-糖尿病肾病-基因数据集导入DAVID 6.8 数据库进行GO 分析及KEGG 通路富集分析，从而得到基因的功能水平分析结果和共同通路。

2 结果

2.1 三七-黄芪活性成分的筛选

通过TCMSP 数据库检索的三七化学成分119 个，黄芪化学成分87 个，通过OB ≥30%和DL ≥0.18 进一步筛选到三七、黄芪潜在活性成分各为8 个和20 个，剔除重复成分1 个，共27 个。见表1。

2.2 三芪口服液治疗糖尿病肾病的潜在作用靶点预测

利用DrugBank 数据库，得到三七、黄芪活性成分靶点各为162 个和180 个，去除重复靶点后得三芪口服液活性成分靶点191 个。在GeneCards 数据库、OMIM 数据库、DisGeNET 数据库共收集糖尿病肾病相关靶点基因共2423 个。利用Venny 2.1.0 工具将药物潜在作用的靶点基因同疾病基因进行映射比对并绘制维恩图（图1），获得共同基因118 个。

2.3 药物-活性成分-关键作用靶点网络构建与分析

将三七、黄芪两味药物共27 个活性成分及118 个关键靶点基因导入Cytoscape 软件进行网络构建及可视化，见图2（封四）。其中连接度最高的化合物有槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、芒柄花素（formononetin）、异鼠李素（isorhamnetin）等；连接度最高的基因有PTGS2、PTGS1、ADRB2、PRSS1、AR、PPARG、ACHE、JUN、AKR1B1 等。

2.4 关键靶点基因蛋白质相互作用网络分析

将三七-黄芪治疗糖尿病肾病的118 个潜在的关键靶点基因导入String 数据库获取蛋白质相互作用关系，再将获得数据导入Cytoscape 软件绘制蛋白关系网络（图3）。以Degree 数值反映节点的大小，节点的Degree 数值越大，节点越大。以Combine score 反映节点连接之间边的粗细，Combine score 越大，边越粗。其中Degree 数值前5 名的靶点基因为JUN、AKT1、MAPK1、RELA、IL-6。表明这些基因在网络中具有重要地位，这些靶点基因在三七-黄芪治疗中具有重要意义，可作为三七-黄芪药对有效成分作用的靶点基因。

2.5 关键靶点基因生物功能及通路分析

GO 分析结果显示，三芪口服液的118 个潜在关键靶点基因的富集的前10 个生物学功能主要为蛋白质异二聚化活性、受体配体活性、细胞因子受体结合、细胞因子活性、血红素结合、磷酸酶结合、下游受体信号传感器活动、RNA 聚合酶Ⅱ转录因子结合、激酶调节剂活性。表明三芪口服液通过参与调控多种生物学过程而发挥治疗糖尿病肾病的作用。KEGG 通路富集分析显示，三芪口服液的关键基因靶点主要富集的通路为糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、IL-17 信号通路、HIF-1 信号通路等。表明三芪口服液的活性成分通过各个通路对糖尿病肾病有治疗作用。见图4～5。

表1 三七与黄芪潜在活性成分

图1 疾病靶点基因与三七-黄芪靶点基因的匹配

图3 三芪口服液的蛋白质互相作用网络

3 讨论

图4 三芪口服液治疗糖尿病肾病关键靶点的GO 生物学过程富集分析

糖尿病肾病是糖尿病的常见并发症之一，是慢性肾脏病的第二大原发病。杨霓芝教授根据多年的临床经验，认为糖尿病的基本病机为气虚血瘀证[7]。益气活血法为治疗糖尿病肾病的基本大法，应贯穿于糖尿病肾病治疗的始终。根据这一理论，杨教授主持开发了广东省院内制剂——三芪口服液，在临床治疗中收到了良好的疗效[8]。动物实验发现，三芪口服液可减轻实验性糖尿病肾病模型大鼠蛋白尿及肾脏损害，改善脂质代谢，并且可以控制血糖和改善肾血流动力学，发挥肾脏保护作用[5，9]。在三芪口服液的初步药理机制研究中发现，三芪口服液可能通过调节肾组织MMP-9/TIMP-1 蛋白表达，改善Col-Ⅳ代谢，以及抑制肾组织TGFβ-1 表达，发挥对糖尿病肾病的保护作用[10-11]。具体机制仍需进一步研究。

在三芪口服液的药物-活性成分-基因靶点网络中，活性成分槲皮素、山奈酚、芒柄花素、异鼠李素等是网络中的重要节点。研究表明，槲皮素能通过抑制氧化应激改善肾功能不全及肾脏病理损伤[12-13]。山奈酚通过抑制细胞中高血糖诱导的RhoA 活化，降低氧化应激、促炎细胞因子（TNF-α 和IL-1β）和肾脏纤维化[14]。芒柄花素也证实了可以减轻肾脏损害，改善肾功能[15]。异鼠李素通过抑制NF-κB 信号通路发挥肾脏保护作用[16]。目前的相关研究均证实了三七与黄芪的活性成分对糖尿病肾病有治疗作用，也说明了预测的合理性。而在重要的基因节点中，有研究发现，PPARG 是中国糖尿病肾病进展的风险[17]。在一项中国的前瞻性队列研究[18]中发现，IL-6 基因多态性可作为中国2 型糖尿病患者肾病进展的预测因子，而另一项研究[19]表明，IL-6 基因增加1 型糖尿病肾病患者白蛋白与肌酐的增加以及不利于血糖、血脂控制。PTGS2、PTGS1、ADRB2、PRSS1、AR 等基因目前还未有明确的证据研究，或许可作为糖尿病肾病研究的新靶点。

GO 分析结果显示，富集的关键基因靶点涉及的生物学过程细胞因子、受体结合、RNA 聚合酶转录。KEGG 通路富集分析显示，三芪口服液通过糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、IL-17 信号通路、HIF-1 信号通路等信号通路发挥对糖尿病肾病的治疗作用。研究证实，AGERAGE 信号通路是糖尿病及其并发症发病机制中的信号传导机制[20]，通过氧化应激加重糖尿病血管损伤[21]，增加肾功能恶化及心血管事件风险，导致全因死亡率增加[22]。在一项病例对照及生物学分析的研究中发现，糖尿病肾病患者的PI3K/Akt、流体剪切应力和动脉粥样硬化、AGE-RAGE、TGF-β1 和松弛素信号通路的基因的循环miRNA 表达上调[23]。许多研究表明[24-26]，IL-17 通过促炎性反应加重糖尿病肾病进展，而一项新的研究[27]却发现，低剂量IL-17 疗法可以预防和逆转糖尿病肾病、代谢综合征和相关器官纤维化，这可能是因为IL-17 对炎症的调节作用依赖于疾病背景、组织、同种型和受体-配体相互作用[28]。缺氧诱导因子HIF-1 能介导缺氧和诱导糖尿病肾病纤维化[29]，但是开发脯氨酰羟化酶抑制剂以促进HIF 活性以治疗肾性贫血也可能靶向糖尿病诱导的肾缺氧，需要进行进一步的临床试验验证结果[30]。

总之，本研究运用网络药理学方法，探讨了三芪口服液主要成分治疗糖尿病肾病的复杂网络关系及机制。研究结果表明三芪口服液主要活性成分、作用靶点、生物学过程及相关通路，为进一步研究其治疗机制提供新思路，但其结果仍需进行相关基础研究及相关研究进行验证。