复方钩藤降压片干预高血压左心室肥厚血浆代谢组学的通路分析

冯 宇 俞赟丰 周曼丽 王健章 张家齐 钱舒乐 简维雄

湖南中医药大学中医学院，湖南长沙 410208

复方钩藤降压片主要由钩藤、麦冬、川芎等中药组成。近年来，通过对复方钩藤降压片进行临床及实验研究[1-2]，证实其可抑制机体炎症状态，为其降压机制提供了新依据。

本研究前期运用代谢组学技术[3]试从小分子代谢产物层面阐释其作用机制。结果发现共有11 种代谢产物与复方钩藤降压片组相关：胞嘧啶核苷酸、腐胺、来苏糖酸、二十四烷酸、甘油酸、肌醇、肌苷、山梨糖醇、木糖醇、核糖、乳酸。为从代谢途径水平了解细胞或组织的生物学意义[4]，故进行下一步的KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）、HMDB（the hu man metabolome database）、MetaboAnalyst 数据库等信息分析。具体内容如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级12 周龄自发性高血压大鼠16 只，雄性，180～220 g。购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格许可编号：20141020，饲料购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，饲养于湖南中医药大学实验中心。

1.2 代谢谱来源

本研究前期实验[3]显示，复方钩藤降压片组和替米沙坦组的血浆代谢产物通过模式识别：复方钩藤降压片组与腐胺、胞嘧啶核苷酸、甘油酸、来苏糖酸、二十四烷酸、肌醇、肌苷、木糖醇、山梨糖醇、核糖、乳酸有关。

1.3 分析软件

通路分析采用KEGG（http：//www.genome.Jp/kegg/）、MetaboAnalyst 网络软件（http：//www.metaboanalyst.ca）分析代谢产物相关的酶、转运蛋白和相关性质。

2 结果与分析

2.1 代谢组产物检索匹配情况

有11 种代谢产物与复方钩藤降压片组有关，将其在KEGG 和HMDB 中进行检索，相应的ID 号。见表1。

2.2 代谢产物路径分析

MetaboAnalyst 分析后，生物代谢通路显示，11 种代谢产物参与14 条代谢路径，通路见表2、图1。通过拓扑分析计算表中代谢通路的影响，选出P＜0.05 的2 条代谢路径（磷酸戊糖路径和嘌呤代谢）。图2～4 显示了具有较高影响值的2 条通路的详细结构，结果显示其内源性代谢物在实验过程中有明显波动，对左心室肥大有显著影响。

表1 高血压左心室肥大血浆代谢组产物基本注释表

表2 通过MetPA 得到的独特的通路分析结果

2.2.1 磷酸戊糖途径 经葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化后葡萄糖-6-磷酸形成6-磷酸葡萄糖内酯，6-磷酸葡糖酸通过6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶氧化脱羧形成核酮糖-5-磷酸。核酮糖-5-磷酸通过核酮糖-5-磷酸异构酶或核酮糖-5-磷酸差向异构酶分别生成核糖-5-磷酸或木酮糖-5-磷酸。核糖-5-磷酸通过核糖磷酸焦磷酸激酶产生核糖磷酸焦磷酸。7-磷酸在转酮醇酶作用下生成核糖-5-磷酸。木酮糖-5-磷酸通过转酮醇酶生成景天庚酮糖-7-磷酸和甘油醛-3-磷酸。甘油醛在乙醛脱氢酶作用下生成甘油酸，再在甘油2-激酶催化下产生2-磷酸甘油酯。见图2。

2.2.2 嘌呤代谢 核糖-5-磷酸通过葡萄糖磷酸变位酶2的作用转化为核糖-1-磷酸。磷酸戊糖焦磷酸激酶催化核糖-5-磷酸生成5-磷酸核糖-α-焦磷酸（PRPP）。5-磷酸核糖-1-焦磷酸在磷酸核苷酸胺转移酶的作用下产生5-磷伯胺。见图3。

2.2.3 嘌呤代谢 肌苷二磷酸通过外核苷三磷酸双氢化酶产生肌苷。肌醇5’-四磷酸在酶的作用下产生肌苷。肌苷在三磷酸肌苷焦磷酸酶的作用下产生次黄嘌呤核苷酸（IMP）。见图4。

3 讨论

左心室肥厚（LVH）通常表现为室壁增厚、心肌重塑和心肌重量增加，是机体对长期增加的血液流动学负荷的一种适应性改变[5]。在复方钩藤降压片干预的动态过程中，11 种代谢产物对应于KEGG 中的共有14 条通路，其中2 条显著富集，3 种蛋白质（核糖-5-磷酸、甘油酸、肌苷）参与了重要通路。

图1 用MetPA 分析得到的通路分析概要图

图2 Pentose phosphate pathway 代谢通路的结构

图3 Purine metabolism 代谢通路的结构局部放大图

图4 Purine metabolism 代谢通路的结构局部放大图

磷酸戊糖路径（Pentose phosphate pathway，PPP）是细胞内葡萄糖的代谢路径之一，是DNA 和RNA 在体内合成戊糖的唯一来源[6-7]。有研究[8]表明，内皮中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺失会降低一氧化氮利用率以致内皮功能障碍。内皮功能障碍时，收缩因子与内皮舒张失衡，影响内皮素-1，它可通过各种信号转导途径，产生成纤维细胞，促进心肌肥厚及心肌纤维化[9-10]。实验[11]证明NADPH 的减少会引起氧化应激，并损伤脂肪与蛋白质。其中氧化应激在研究中显示参与了心肌重构生理病理过程[12]。川芎中主成分川芎嗪能改善炎性反应及氧化应激[13]，由此川芎可能干预此代谢通路阻止心肌重构发生。

在磷酸戊糖路径（pentose phosphate pathway，PPP）中有核糖-5-磷酸（C00117）和甘油酸（C00258）参与。甘油醛在乙醛脱氢酶作用下生成甘油酸，其中在心肌梗死、缺血灌注等心肌损伤过程中乙醛脱氢酶可起到保护心肌的作用[3]。核糖-5-磷酸可用于核酸的生物合成。当心肌细胞脱氧核糖核酸与核糖核酸合成过多时，会使心肌细胞体积增大及肥厚引起左心室肥厚[14]。钩藤中有效成分钩藤碱能抑制血管平滑肌增殖、降低平滑肌张力[15]，改善心室结构。钩藤可能在代谢通路中起作用，影响心室结构。

用于心肌嘌呤补救合成途径的前体物质包括腺苷和肌苷。腺苷可通过腺苷激酶途径合成ATP，以增加缺血心肌能量的保存。肌酐参与腺苷脱氨酶-嘌呤核苷磷酸化酶-磷酸核糖焦磷酸转移酶系统，转化为AMP，磷酸化的AMP 合成ATP 以增加心肌能量的物质储存[16]。肌苷可抑制磷酸核糖焦磷酸（PRPP）在体内的活化，从而改善心肌的能量状态，氧化导致的细胞损伤也可以得到缓解[17]。腺苷可从抑制ROS 的生成与中性粒细胞的活化、抗炎作用等多个方面进行心肌的保护[18]。麦冬也可减轻炎性反应[19-20]，促进心肌保护。

在嘌呤代谢通路中有肌苷（C00081）和核糖-5-磷酸（C00117）参与。肌苷可通过抑制核蛋白聚腺苷二磷酸核糖聚合酶阻止一氧化氮化酶，使一氧化氮（NO）的合成降低，保护细胞的膜性结构[21-22]。在心血管系统中，NO 的生物效应降低由自由基不平衡而引起，从而引起心肌纤维化与心肌细胞肥大等现象。在体内，次黄嘌呤核苷酸可产生类似于NO 供体的生物效应，以改善受损血管内皮的功能，提高心肌收缩力[23]。钩藤中主要成分异钩藤碱可有效抑制NO 释放[24]，麦冬有效成分可保护血管内皮细胞[25]，都能促进膜性结构恢复。核糖激酶将核糖磷酸化，随后磷酸化的核糖参与嘌呤代谢，核糖水平降低，可能与膜体结构的恢复引起腺苷酸激酶活性增加相关[26]。

通过通路分析构建的网络图，发现该药物可能对通路中某些代谢产物或酶等进行特异性干预，从而恢复正常细胞结构，调节脂肪酸代谢等。且实验研究[1，7]复方钩藤降压片相对于西药，降压效果更明显。而复方钩藤降压片在干预左心室肥厚过程中，对通路中某些血浆代谢产物的作用仍需要通过实验进一步生物学验证。