莱菔硫烷抑制二乙基亚硝胺诱发大鼠肝细胞肝癌的作用*

冯明辉， 贺松其， 董晓飞， 赵晓庆， 林 铮， 王嘉吉， 庞 杰△

(1广州中医药大学第三附属医院肿瘤科, 广东 广州 510000； 2南方医科大学中医药学院， 广东 广州 510515)

根据国际癌症研究机构的一项全球性肿瘤研究，肝癌目前已成为全球第6大最常见的肿瘤[1]，其中，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)作为肝癌的最主要和常见的形式，其预后极差，死亡率高。肿瘤诱因具有多种假说，其中炎症诱发癌基因表达的假说得到了当今医学界的认可[2]。近年来，由于HCC发病率不断上升，且具有预后不良和潜在发展性的特点，因此，如何有效地防治HCC已经成为一个具有挑战性和现实性的问题。

莱菔硫烷(sulforaphane，SFN)是硫代葡萄糖苷的水解产物，通常存在于十字花科蔬菜中， SFN在过往的实验模型中表现出抗肿瘤的特性[3]。氧化应激是肿瘤发生的其中一个可能的环节，机体的抗氧化酶系统主要包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)系统，其中核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)通路被证明与抗氧化蛋白SOD和GPx等有关[4-5]，而研究也表明，SFN能促进Nrf2的核转录从而加强抗氧化酶的表达，抑制氧化应激。同时，SFN具有上调Nrf2的功能[6]。同时，Thimmulappa等[7]曾报道SFN具有有效的抗炎作用，其机制是通过抑制DNA与NF-κB的结合，减少炎症和肿瘤信号因子诱导物细菌脂多糖的生成，并使机体刺激产生的氧化应激物质在原巨噬细胞中的表达下调。此外，Heiss等[8]的研究显示，SFN可通过激活Fas/FasL途径来诱导HepG2细胞凋亡。

基于莱菔硫烷所具有的抗炎和抗肿瘤作用，我们试图探究SFN是否在HCC发生中起到一定的预防作用，并初步探索SFN发挥作用的可能机制。

材 料 和 方 法

1 实验材料

1.1实验动物 7周龄雄性SD大鼠50只，体重200～230 g，购自南方医科大学动物实验中心，动物的生产许可证号为SCXK(粤)2019-0011，动物的使用许可证号为SYXK(粤)2019-0022。实验动物在标准清洁级环境下喂养，食物和水自由摄取。本实验遵循3R原则，所有的大鼠均放置在适当的通风条件下，温度为(21±2) ℃，湿度为(60±5)%，维持12 h的暗光循环。

1.2实验试剂 HE染色试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、总胆红素(total bilirubin，TBIL)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、IL-10和转化生长因子β(transforming growth factor β, TGF-β)的ELISA试剂盒(上海鲁纹生物)；Masson 染色试剂盒(Biosis)； SOD、GPx、CAT和丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒(南京金斯瑞生物)。

2 方法

2.1动物分组与处理 随机将50只SD大鼠分为5组： 对照(control,Con)组、DEN造模(DEN)组、DEN+SFN低剂量干预(DEN+SFN-L)组、DEN+SFN中剂量干预(DEN+SFN-M)组和DEN+SFN高剂量干预(DEN+SFN-H)组，每组10只大鼠。各组大鼠适应性饲养3 d后，进行动物造模处理。根据预实验结果进行DEN造模处理。预实验显示，每周注射一次50 mg/kg的DEN，反复注射12周时出现肝硬化或纤维化但无癌变结节，而反复注射18周时出现大量癌变结节。故本实验选择每周注射一次50 mg/kg DEN，持续18周进行造模；而SFN干预时间是从第12周起，SFN干预剂量根据文献[9]剂量并稍作修改。具体动物实验方法为：对照组大鼠在18周内，每周腹腔注射1次0.2 mL生理盐水，并在第12～18周，同时每天灌胃0.2 mL PBS；DEN造模组大鼠在18周内，每周腹腔注射一次0.2 mL生理盐水配制的DEN溶液(剂量为50 mg/kg大鼠体重)，并在第12～18周，同时每天灌胃0.2 mL PBS；SFN干预组大鼠在18周内，每周腹腔注射一次0.2 mL生理盐水配制的DEN溶液(剂量为50 mg/kg大鼠体重)，并在第12～18周，同时每天灌胃0.2 mL PBS配制的SFN溶液，其中DEN+SFN-L组为低剂量 0.19 mg/kg，DEN+SFN-M组为中等剂量0.38 mg/kg，DEN+SFN-H组为高剂量 0.57 mg/kg。在第18周结束时，麻醉大鼠，取出肝脏，观察并记录肝脏的大小、重量、颜色和形态，并一部分固定在福尔马林中进行组织学检查，另外一部分冰冻在-80 ℃。

2.2HE染色和Masson染色 将肝脏组织在4%甲醛溶液中浸泡过夜进行固定，而后将其包埋在石蜡中，切成5 μm厚的切片，根据HE染色试剂盒说明书标准流程步骤进行HE染色。Masson染色石蜡切片制作法与HE染色相同，切片制作后根据Masson染色试剂盒说明书标准流程步骤进行Masson染色。染色后，中性树胶封闭切片，在显微镜下观察，并随机采集6个视野的图像。

2.3ELISA法检测酶含量和炎症因子的含量 将冰冻的肝脏组织切块，在4 ℃下使用匀浆机将肝脏组织与Tris-HCl缓冲液混合并制成10%的组织匀浆，用等量的乙醇提取上清液，在2 500 r/min的设定下离心10 min，取上清液后用生理盐水5倍进行稀释，而后取50 μL作为实验样本，用pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液溶解抗原，之后根据ELISA实验说明书标准流程步骤，经加样、孵育、洗板、显色、读板等步骤测量肝组织中ALT、AST、ALP、TBIL、IL-10、TGF-β、IL-1α、 IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。

2.4分光光度法测定氧化应激指标 将冰冻的肝脏组织切块，在4 ℃下使用匀浆机将肝脏组织与Tris-HCl缓冲液混合并制成10%的组织匀浆，用等量的乙醇提取上清液，在2 500 r/min的设定下离心10 min，取上清液后用生理盐水5倍进行稀释，而后取50 μL作为实验样本，按照试剂盒说明书标准流程步骤，用分光光度法分别测定SOD、GPx和CAT活性以及MDA含量，用U/g或者μmol/g表示。

3 统计学处理

利用GraphPad Prism 7.0软件进行后续统计学分析。实验数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组定量资料的比较采用单因素方差分析方法。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 莱菔硫烷抑制DEN诱导的大鼠肝癌发生

对照组的肝脏呈红褐色，质地柔软，表面光滑无结节。给予DEN诱导HCC模型后，DEN造模组肝脏的颜色为黄褐色，表面暗淡无光泽，呈现大小不一的癌变结节，且结节数目多。经过不同给药剂量的SFN干预处理后，宏观观察下肝脏癌变结节化的程度随SFN剂量的增高而降低，提示莱菔硫烷具有一定抑制DEN诱导的肝癌发生的作用，见图1。

Figure 1.Sulforaphane (SFN) inhibited DEN-induced hepatocarcinogenesis in the rats. Representative images of the livers were showed.

图1 莱菔硫烷抑制DEN诱导的肝癌发生

2 莱菔硫烷对DEN处理后大鼠肝脏组织病理学改变的影响

对照组的肝脏组织内肝叶结构完整，肝细胞排列整齐，细胞核清晰；DEN造模组的肝组织结构紊乱，表现为含有大量假小叶的无序结构，小叶内可见局灶性细胞坏死和大量纤维化，伴有大量炎细胞浸润、异型细胞较多且细胞具有不规则形状的细胞核(非典型性癌细胞灶)；DEN+SFN-L干预组的肝组织形态与DEN造模组类似，含有大量假小叶的无序结构，小叶内可见局灶性细胞坏死和纤维化，伴有大量炎细胞浸润和非典型性癌细胞灶；DEN+SFN-M干预组的肝细胞损伤程度较高，部分发生纤维化，且可见假小叶形成和部分非典型性癌细胞，多见炎细胞浸润；DEN+SFN-H干预组的肝组织结构趋向于正常，肝组织纤维化程度较低，未见明显的假小叶形成，癌变细胞较少，炎细胞浸润较少，见图2。这提示SEN可减少炎症细胞浸润，减轻肝组织纤维化，一定程度上抑制癌变发生。

Figure 2.Sulforaphane (SFN) attenuated DEN-induced inflammatory cell infiltration, hepatic fibrosis and cell carcinogenesis in the liver tissues of the rats. A: the liver tissues in each group were stained with hematoxylin and eosin (HE); B: the liver tissues in each group were stained with Masson’s trichrome. The scale bar=250 μm.

图2 莱菔硫烷能减轻DEN诱导的大鼠肝组织炎细胞浸润、肝纤维化和细胞癌变

3 莱菔硫烷减轻DEN诱导的肝脏损伤

对照组肝脏的ALT、AST、ALP和TBIL含量较低；DEN组肝组织中ALT、AST、ALP和TBIL的含量均显著增加；SFN干预组肝组织的ALT、AST、ALP和TBIL含量有所下降，且高剂量SFN干预组相比于DEN组明显下降(P<0.01)，甚至接近于正常肝脏的水平，见图3。这些生化指标的改变表明莱菔硫烷可以使肝细胞坏死减少，减轻肝损伤，维持肝脏的正常功能。

Figure 3.The effects of sulforaphane (SFN) on the liver function in the rats after DEN exposure. Mean±SD.n=10.*P<0.05，**P<0.01vsDEN group;##P<0.01vscontrol group.

图3 莱菔硫烷对DEN处理后大鼠肝功能的影响。

4 莱菔硫烷减轻DEN引起的肝组织炎症应答

对照组的组织正性调控因子IL-1α、 IL-1β、 IL-6和TNF-α含量较低，负性调控因子IL-10和TGF-β的含量较高；DEN组的正性调控因子IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著升高，而负性调控因子IL-10和TGF-β的含量显著降低；SFN干预组的肝组织正性调控因子IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α含量有所降低，而负性调控因子IL-10和TGF-β的含量有所升高，且高剂量SFN干预组与DEN组相比差异最明显，甚至接近于正常肝脏水平，见图4。这提示莱菔硫烷可使DEN所致的炎症正性调控因子升高和负性调控因子降低的现象得到改善，从而调控肝组织的炎症反应，减少炎症对肝细胞的损伤。

Figure 4.The effect of sulforaphane (SFN) on hepatocyte inflammation in the rats after DEN exposure. Mean±SD.n=10.*P<0.05，**P<0.01vsDEN group;##P<0.01vscontrol group.

图4 莱菔硫烷对DEN处理后大鼠肝细胞炎症反应的影响

5 莱菔硫烷减轻DEN对肝组织的过氧化应激反应

对照组肝组织的SOD、CAT和GPx活性较高， MDA含量较低；DEN组肝组织的SOD、CAT和GPx酶活性显著降低，而MDA含量显著增高；SFN干预的组肝组织的抗氧化酶SOD、CAT和GPx活性有所升高，且MDA浓度有所回落，抗氧化酶和过氧化物的改变程度与SFN剂量呈正相关(P<0.01)，见图5。这提示莱菔硫烷可升高肝组织SOD、CAT和GPx酶活性，减少MDA的产生，保护肝细胞不受氧化应激的损伤，提高肝脏抗氧化能力，一定程度上可减少DEN诱导的大鼠体内的氧化应激反应。

讨 论

HCC是世界上最常见的恶性肿瘤之一，并且由于其恶性程度高、发生率高而成为肝癌的主要形式[10]。HCC被认为是一种由多基因参与和经多步骤演进的疾病过程，可能涉及各种致病因素，如肝炎病毒感染、致癌毒性物质损害和乙醇摄入[11]。目前对HCC的治疗策略仍然选择有限，而有效的化学预防策略是遏制全球迅速增加的肝癌死亡率最可行的手段之一。

Figure 5.The effects of sulforaphane (SFN) on oxidative stress in the liver tissues of the rats induced by DEN. Mean±SD.n=10.*P<0.05，**P<0.01vsDEN group;##P<0.01vscontrol group.

图5 莱菔硫烷对DEN处理的大鼠肝组织氧化应激反应的影响

DEN诱导的HCC模型与人体HCC相似，是研究肝癌发生和筛选潜在防治HCC药物最广泛使用的实验模型之一[12]，因此本研究采用DEN诱导HCC模型。通过DEN反复刺激18周后，宏观观察发现DEN组大鼠肝脏具有明显的癌性结节性改变，提示HCC发生。进一步，经组织学分析可见，DEN组大鼠的肝组织中可观察到许多病理性异常，肝脏组织结构紊乱，遍布包含有大量假小叶的无序结构，炎症细胞大量浸润，肝组织结构内充满具有不规则形状细胞核的异型细胞(癌细胞病灶)，所有这些信息都表明我们的DEN诱导的HCC模型是成功的。

莱菔硫烷是目前研究界认为的蔬菜中具有防癌、抗癌效果的天然活性物质之一[13]。流行病学和活体试验表明，莱菔硫烷能够有效降低肺癌和胃癌等肿瘤的发生[14]。莱菔硫烷通过在DNA修复、消除炎症、造成肿瘤细胞的凋亡等方面发来发挥其抗癌活性[15-16]。作为一种较易获得的物质，莱菔硫烷在防治肿瘤药物的开发方面具有极大的科研价值。在我们的研究中，经SFN干预后，DEN诱导的肝组织的癌变结节数目显著降低，癌变情况改善，提示SFN具有一定的抑制肝癌发生的作用。既往的研究认为，体内反复炎症反应的过度激活和持续反复的损伤可诱导癌基因的激活，从而导致细胞的癌变[17-19]。为初步探讨SFN改善HCC大鼠癌变情况的机制，我们接着对肝损伤、炎症反应指标进行了检测。AST、ALT、ALP和TBIL水平通常可反映肝损伤的程度，其增加水平是肝功能损伤的重要指标[18]。我们的研究结果显示，DEN诱导的HCC模型中肝组织中TBIL、ALT、AST和ALP水平显着高于对照组，即DEN可诱导肝细胞的损伤和肝功能的损害；而SFN组能抑制DEN诱导的肝细胞的损伤和肝功能的损害。

炎症因子可影响细胞的微环境，与炎症及肿瘤的发生发展有密切的关系，IL-10和TGF-β为负性调控因子，IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α为正性调控因子。我们发现经DEN诱导的HCC大鼠肝组织具有促炎效应的正性调控因子IL-1α、IL-6、IL-1β和TNF-α表达增加，具有抗炎效应的负性调控因子IL-10和TGF-β表达下降，说明DEN可加强HCC大鼠肝组织的炎症反应；而给予不同剂量的SFN后，肝组织促炎因子含量下降，抗炎因子含量上升，一定程度说明了SFN具有抗炎作用，可降低DEN诱导的肝组织炎症反应。

以往的研究结果表明，氧化应激在肝细胞癌的发生发展中都具有重要作用[20]，SOD、CAT和GPx是机体重要的抗氧化酶，有减缓氧化速度、清除机体有害物质的能力；MDA是脂质过氧化物，可反映机体内脂质过氧化程度。为探讨SFN减轻HCC是否与氧化应激反应有关，我们使用分光光度法检测肝组织SOD、CAT和GPx的活性以及MDA的含量。结果显示，SFN能减少DEN所致肝组织内脂质氧化产物MDA含量，提升抗氧化酶SOD、CAT和GPx的活性，由此可推测，SFN在DEN诱导的肝组织内发挥有抗氧化作用，可在一定程度上保护肝脏免受氧化损伤。

综上所述，我们的实验结果初步表明，莱菔硫烷具有抑制DEN诱导的HCC发生的作用，这种作用可能与SFN减轻DEN诱导的炎症反应和肝损伤，同时增强肝组织的抗氧化能力有关。因此莱菔硫烷可作为HCC潜在的防癌药物。本文采取动物模型的方法，通过SFN干预方式探究其对DEN诱导的肝组织的保护作用及初步机制，考虑的机制包含炎症和氧化应激，但由于动物实验与人体环境具有一定的差异，未来仍需更多的实验来验证我们的实验结果。