降酸酵母结合乳酸菌对‘黑虎香’葡萄酒酸度的影响

钟映雪，张晓芳，杨瑞群，陶芳，南立军,2*，李雅善,2*（

1. 楚雄师范学院化学与生命科学学院，云南楚雄 675000；2. 云南省高校葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，云南楚雄 675000）

黑虎香（Fox）是美洲葡萄和夏葡萄的杂交品种，果穗长，圆锥形，皮厚而多肉，青黑色，色泽鲜艳，酸甜可口，可溶性固形物含量可达17%以上，耐贮运[1]。在云南楚雄表现为粒大、有籽、糖高、酸高，多用作鲜食，只有少部分用于酿酒。

由于生态条件、品种特性及栽培方式等差异，造成葡萄原料酸度过高，酿出的葡萄酒品质不佳，所以需要降酸，来协调其口感。目前，葡萄酒降酸的主要方法有化学降酸法、物理降酸法、微生物降酸法[2]，以及与低酸葡萄汁混合来平衡酸度。以前葡萄酒生产中普遍采用物理降酸法和化学降酸法，只能作用于酒石酸而不能对生理代谢较为活跃的苹果酸起作用，对酒的负面影响较大，而且常引起葡萄酒的瓶内发酵[3]。生物降酸法主要是利用乳酸菌将苹果酸降解为乳酸，而导致酸降低的主要微生物是明串珠菌、乳酸杆菌、葡萄球菌和酵母菌[4-5]。有大量研究发现，酿酒酵母共有18属70余种。其中一些酵母菌株具有降解苹果酸的能力。新西兰由于气候相对冷凉，葡萄含酸量较高，广泛采用酵母菌株Lalvin-D432和Lalvin-71B降酸[6]。本试验采用降酸酵母和乳酸菌降低‘黑虎香’葡萄酒中的酸度，进而改进‘黑虎香’葡萄酒的口感。

目前，大多数红葡萄酒都使用苹果酸-乳酸发酵降酸，耗时较长；另一种途径是利用粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）降酸。在苹果酸-酒精发酵（MAF）中将苹果酸分解为乙醇和CO2，从而达到降酸的目的。该方法能保持酒的清爽感与口感，实现发酵和降酸同步进行[3]。

1 材料与方法

1.1 原料与辅料

1.1.1 原料

‘黑虎香’葡萄于2019年4月5日购于楚雄市东兴农贸市场，颗粒饱满、色深、皮厚、无核，可用来酿酒。

1.1.2 辅料

帝伯仕（Diboshi）降酸酵母，帝伯仕乳酸菌（FML EXPERTISE S），来自法国。安琪酵母，安琪酵母股份有限公司提供。果胶酶，来自南宁庞博生物工程有限公司。

1.2 仪器与试剂

电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司。UV-5500紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司。PB-10酸度计。HWS26电热恒温水浴锅。TG328A分析天平，上海精科仪器厂。

1.3 方法

为了在正常发酵条件下研究降酸酵母在‘黑虎香’葡萄酒中的降酸作用，每一罐样品中加入200 mg/L安琪酵母，同时使用4组不同浓度的帝伯仕降酸酵母启动酒精发酵，并分别命名为罐1、罐2、罐3和罐4。酒精发酵过程中每天测定还原糖、总酸、pH、可溶性固形物、色度、单宁含量，酒精发酵结束后分析降酸酵母对‘黑虎香’葡萄酒的降酸效果及对上述基本指标的影响，结合降酸效果及各项指标含量，选择出最佳降酸酵母用量的一组，并将本组继续进行苹果酸-乳酸发酵试验。

酒精发酵结束后，将4组不同浓度（0、5 mg/L、10 mg/L和15 mg/L）的帝伯仕乳酸菌添加进上述选出的‘黑虎香’葡萄酒中，启动苹果酸-乳酸发酵，每隔5 d测一次总酸、色度、pH，研究乳酸菌对‘黑虎香’葡萄酒的降酸效果及对pH、色度的影响，选出最佳乳酸菌添加量。

1.3.1 基本指标的测定方法

糖、酸和挥发酸依据GB/T 15038—2006总糖、总酸和挥发酸的测定方法[7]；密度瓶法测酒度[8]；分光光度计法测色度[9]；高锰酸钾滴定法测单宁[10]；pH示差法测花色苷[11]；折光仪法测可溶性固形物[12]。

1.3.2 工艺流程关键控制点用恒温水浴锅将温度控制在20～22 ℃。为了防止发酵过快，导致降酸酵母作用效果不明显的现象发生，将温度尽量控制的较低。

1.4 统计分析

采用SPSS和Excel 2003进行数据分析和作图。

2 结果与分析

2.1 原料基本指标值

原料各项基本指标含量如表1。此批‘黑虎香’葡萄原料糖度较低而总酸较高，用来研究微生物降酸效果可极大的提高试验显著性，原料卫生标准良好，pH正常，花色苷、色度、单宁和可溶性固形物含量均较好。

表1 原料基本指标数值Table 1 Value of basic indicators of raw materials

2.2 酒精发酵期间温度和比重的变化

2.2.1 罐1

4月5日，原料入罐。第2天下午开始发酵，葡萄醪上浮并伴有大量起泡产生，果香浓郁。第3天，进入发酵旺盛期，能略微闻到酒香，但果香占主导，底部出现白色酒石沉淀。第4天，酒香越发浓郁，果香略微减弱，白色酒石沉淀增多。至第6天，发酵开始减弱，底部白色酒石以及其他沉淀增多。至第7天，发酵几近终止。之后，开始皮渣分离。

罐1使用的是200 mg/L安琪酵母（不加降酸酵母），其发酵特性是对酒精发酵的启动最慢，直至4月6日下午，酒精发酵速度才加速，一直持续到4月9日，开始减慢，直至发酵终止。发酵期间温度起着重要作用，4月5～6日温度快速上升，之后下降；4月8日降到最低点，然后又快速上升；4月10日上升到最高，然后缓慢下降；到4月12日又开始上升。整个发酵期间，温度变化范围始终保持在20～22 ℃（图1）。

图1 罐1的发酵曲线Figure 1 Fermentation curve of tank 1

2.2.2 罐2

4月5日，原料入罐。第2天，有少许小气泡产生，果香浓郁，温度上升。4月7～8日，发酵旺盛，葡萄醪上浮，伴有大量气泡产生，酒香出现，但果香占主导，比重明显降低，底部出现白色酒石沉淀。之后，发酵减弱，酒香浓郁，底部白色酒石及其它沉淀增多，比重降低缓慢至趋于平缓。4月12日，酒精发酵基本结束，气泡微弱，葡萄醪香气几近散失，比重维持不变。皮渣分离。

如图2所示，酒精发酵启动后，发酵基质温度明显上升。之后通过水浴锅恒温控制温度，才使温度逐渐趋于平衡，酒精发酵平稳进行；葡萄汁比重开始下降，其下降速度先慢后快再变慢，4月6日开始快速下降，4月8日减慢，4月9日发酵速度几乎停滞，反映出酒精发酵速度趋势。与此同时，温度在4月6日上升到最高，然后下降，在4月8日降到最低点，又逐渐上升至最高，保持3 d，进行轻微的波动。

图2 罐2的发酵曲线Figure 2 Fermentation curve of tank 2

2.2.3 罐3

4月5日，原料入罐。第2天，开始发酵，葡萄醪上浮并伴有少量气泡产生，果香浓郁。第3天，发酵旺盛，略微闻到酒香，但果香占主导，底部出现白色酒石沉淀。第4天，酒香突出，果香开始减弱，白色酒石沉淀增多。至4月11日，发酵减弱，酒香浓郁，皮渣上浮十分缓慢。4月12日，酒精发酵结束，气泡微弱。皮渣分离。

如图3所示，4月5日原料入罐后，从6日开始比重下降速度增快（比2号罐快）；至4月7日，发酵速度开始减慢，4月9日发酵速度极慢，并于4月11日后趋于平缓，下降速度很快趋近于0。温度的波动趋势与图2相似。

2.2.4 罐4

4月5日，原料入罐。第2天发酵启动，葡萄醪上浮并伴有少量起泡产生，果香浓郁。

第4天，发酵进入旺盛期，酒香逐渐浓郁，果香略微减弱，白色酒石沉淀增多。至4月10日，发酵开始减弱，酒香浓郁，底部白色酒石及其它沉淀增多。在4月12日时，气泡微弱，葡萄醪香气几近散失。之后开始皮渣分离。

在4个处理罐中，罐4最先启动酒精发酵。因此，在发酵前期，发酵速度极快，4月6～8日为快速发酵期，之后迅速减慢，4月10日发酵速度几乎为0，逐渐趋于平缓；当比重不再发生变化时，开始皮渣分离（图4）。总体上，罐4温度的变化趋势与上述几罐相似，不同的是罐4的发酵温度在4月9日是所有处理中最高的，达到了23 ℃。但到发酵后期，发酵基质温度降低，此时无需再频繁降温。

图3 罐3的发酵曲线Figure 3 Fermentation curve of tank 3

图4 罐4的发酵曲线Figure 4 Fermentation curve of tank 4

2.3 酒精发酵期间基本指标的变化

2.3.1 罐1

罐1前期启动发酵最慢。如表2至表5所示，罐1酸度最高。‘黑虎香’葡萄酒中总酸在酒精发酵第3天达到最大值，此后则缓缓降低，而还原糖前3天下降速度较慢，之后开始快速下降，相应可溶性固形物下降也较为规律，色度先升高后降低，但是在4组对比试验中，罐1色度保留最完整，单宁含量先降低后升高再降低，后趋于平衡，最终罐1和罐2单宁含量最高。pH值在发酵过程中较为稳定。

2.3.2 罐2

罐2酒精发酵期间基本指标的变化情况如表3所示，在发酵过程中，添加150 mg/L降酸酵母的‘黑虎香’葡萄酒中的总酸呈先升高后降低的趋势。酒精发酵第4天，酸度开始逐渐降低，发酵第7天下降速度趋于0。因此，酵母的降酸效果较为明显。从表3中可看出，‘黑虎香’葡萄酒前期发酵速度较快，还原糖下降极快，但是发酵过程中pH较为稳定，可溶性固形物含量逐渐降低，总酸、色度不断上升，并在发酵第3天达到最大值，而后呈下降趋势。单宁含量先降低，而后在第3天达到最大值，此后则不断下降，直至发酵后期趋于平衡。

2.3.3 罐3

罐3酒精发酵期间基本指标的变化情况如表4所示，添加200 mg/L降酸酵母的‘黑虎香’葡萄酒中的总酸，在发酵第3天达到最大值10.78 g/L，此后酸度开始下降，且下降效果明显。发酵过程中，还原糖、可溶性固形物逐渐降低，并且都是前期下降效果明显，后期趋于平缓，pH值在4组对比试验中最为稳定，色度、单宁呈先上升后下降的趋势，并在发酵后期趋于稳定。花色素苷、单宁含量越高，葡萄酒颜色越深，色度值也越高。

2.3.4 罐4

罐4酒精发酵期间基本指标的变化情况如表5所示，酒精发酵过程中，色度与总酸在第3天达到最大值，此时葡萄酒的颜色最深。此后开始下降。总酸在第4天下降幅度最大，后期下降较为平缓。还原糖和可溶性固形物前4天下降速度非常迅速，分别降低到了8.00 g/L和8.4%，之后逐渐降低，而pH在整个试验期间较为稳定。单宁含量在入罐第2天下降，第3天则上升，第4天达到最大值，之后则缓缓下降，发酵后期则趋于平衡。

2.4 酒精发酵结束后基本指标的变化

酒精发酵结束后，残糖含量最低的是罐2，为3 g/L；总酸含量最低的是罐2和罐3，为7.69 g/L；酒精度最高的是罐3，为7.78% vol；花色苷浓度最高的是罐3，为263.3 g/L；可溶性固形物含量最高的为罐1和罐3，均为6.4%；单宁含量最高为罐1和罐2，为0.75 g/L，罐3的单宁含量为0.58 g/L；色度值最大的是罐1，为25.16，其次是罐2，为24.3；挥发酸均保持在较低水平；pH值均在正常范围，故选用200 mg/L降酸酵母发酵而成的葡萄酒（罐3）进行接下来的乳酸菌降酸试验。

2.5 苹果酸-乳酸发酵期间基本指标的变化

2.5.1 pH

采用上述200 mg/L降酸酵母发酵而成的葡萄酒加入帝伯仕乳酸菌进行苹果酸-乳酸发酵。图5所示，苹果酸-乳酸发酵期间4组的pH值均稳定在3.28～3.42。其中，添加了10 mg/L乳酸菌的一组比其它3组更稳定，即添加了10 mg/L乳酸菌进行苹果酸-乳酸发酵的‘黑虎香’葡萄酒稳定性优于添加了5 mg/L和15 mg/L的两组，也优于不添加乳酸菌的对照组。添加5 mg/L乳酸菌的酒样变化最明显，变化幅度最大，最不稳定。

表2 罐1酒精发酵期间基本指标的变化Table 2 Change of basic indexes during the alcoholic fermentation in tank 1

表3 罐2酒精发酵期间基本指标的变化Table 3 Change of basic indexes during the alcoholic fermentation in tank 2

表4 罐3酒精发酵期间基本指标的变化Table 4 Change of basic indexes during the alcoholic fermentation in tank 3

表5 罐4酒精发酵期间基本指标的变化Table 5 Change of basic indexes during the alcoholic fermentation in tank 4

2.5.2 总酸

苹果酸-乳酸发酵期间总酸的变化情况如表6所示，不添加乳酸菌的处理酸度值发生了略微变化，而进行苹-乳发酵的其他3个处理，酸度发生了较大变化。表6显示，5 mg/L乳酸菌处理30 d后酸度降低0.34 g/L，10 mg/L乳酸菌处理30 d后酸度降低0.83 g/L，15 mg/L乳酸菌处理30 d后酸度降低0.68 g/L。综上所述，乳酸菌降酸效果最好的为添加10 mg/L乳酸菌处理。

2.5.3 色度

如表7所示，至发酵第30天，不添加乳酸菌的处理色度最高，为9.94，但是下降幅度最小；3个处理依次为10 mg/L、5 mg/L、15 mg/L，至发酵第30天，分别降低至8.68、8.20和7.21，下降幅度由快至慢依次为添加15 mg/L、5 mg/L、10 mg/L处理。进行苹果酸-乳酸发酵的其他3个处理中，色度最低的为添加了15 mg/L乳酸菌，最高的为添加了10 mg/L乳酸菌，葡萄酒进行苹果酸乳酸发酵可以稳定葡萄酒，因此，总体上添加10 mg/L乳酸菌进行苹果酸-乳酸发酵是最佳的选择，不但色度保留效果最好，而且葡萄酒稳定性也是最好的。

图5 苹果酸-乳酸发酵期间pH的变化Figure 5 Changes in pH during malolactic fermentation

表6 苹果酸-乳酸发酵期间总酸的变化Table 6 The change of total acid during malolactic fermentation

表7 苹果酸-乳酸发酵期间色度的变化Table 7 Chromaticity change during malolactic fermentation

3 讨论与结论

4月6日，罐1酒精发酵才缓缓启动，但启动发酵后发酵速度加快（图1），这与安琪酵母发酵特性有关[13]。在4组对比试验中，罐1色度保留最完整，单宁含量最高。单宁含量先降低后升高再降低，后趋于平衡。pH在发酵过程中较为稳定，表明葡萄酒较稳定[14]。

酒精发酵启动后，发酵基质温度明显上升（图2），主要是酒精发酵过程中产生大量CO2气体和热量[15]，升高了发酵基质的温度。比重下降速度趋近于0时，意味着酒精发酵即将结束，这与栗甲等[16]研究结果一致。

在发酵过程中，添加150 mg/L降酸酵母的‘黑虎香’葡萄酒中的总酸呈先升高后降低的趋势（表3），是因为酒精发酵过程中产生了大量有机酸[17]，提高了酸度。发酵第4天，酸度开始逐渐降低，第7天下降速度趋于0，表明降酸酵母确实具有降酸作用，并且在酒精发酵终止后随即终止[18]。

不添加乳酸菌进行发酵的葡萄酒酸度有略微变化，而其他酒样的酸度均发生了较大变化（表6），证明乳酸菌在苹果酸-乳酸发酵过程中具有一定降酸作用[19]。pH稳定性与葡萄酒稳定性有关，pH稳定性越高，葡萄酒越稳定[14]。苹果酸-乳酸发酵期间4组样品的pH均稳定在3.28～3.42，变化不大，因此，4组葡萄酒均较稳定。经过降酸酵母和乳酸菌发酵后，葡萄酒的稳定性得到了很大提高。

如表7所示，不添加乳酸菌的酒样色度最高。添加乳酸菌后色度开始降低，主要因为乳酸菌能够与SO2结合的物质，如丙酮酸、α-酮戊二酸等释放出游离SO2，而SO2与花色苷结合，导致‘黑虎香’葡萄酒色度降低[20-21]。

降酸酵母作为酿酒酵母的一种，最大的特点是能够在葡萄酒发酵期间起一定降酸作用[22]。本次试验启动酒精发酵采用的是帝伯仕降酸酵母[23]，其特点为耐酸、适应性强、发酵启动较快、发酵温度范围广（18～28 ℃）。能够降低葡萄酒酸度，使口感更加柔和。能够保持葡萄本身特有的香气，在本试验中有明显的体现。因此，具有很大的发展前景。

利用降酸酵母将部分苹果酸转化成乙醇和CO2，或利用乳酸菌将部分苹果酸转化为乳酸，都可柔和葡萄酒中的酸，避免因加入过多化学降酸剂导致质量下降，降低葡萄酒酸度，改善葡萄酒口感[3]。采用不同量的降酸酵母与乳酸菌进行试验，探究两种微生物对‘黑虎香’葡萄酒降酸效果的影响，筛选出最佳的‘黑虎香’葡萄酒降酸工艺，对其它品种的葡萄酒或果酒的降酸也具有一定的参考价值。综上所述，‘黑虎香’葡萄酒酒精发酵过程中，使用帝伯仕降酸酵母的3组酒精发酵启动较快，使用安琪酵母的一组酒精发酵启动较慢。启动‘黑虎香’葡萄酒发酵的最佳降酸酵母用量为200 mg/L，发酵过程中能够降低1.03 g/L的酸。

酒精发酵结束后，不添加乳酸菌发酵的一组样品的酸度值变化甚微，色度保留较好。添加乳酸菌的3组样品中，添加10 mg/L乳酸菌使总酸降低了0.83 g/L，pH变化最平稳，色度值最高，为8.68，色度保留最完整，降酸效果最好，酒的稳定性最好。