靶向抑制TANK结合激酶1表达对舌及下咽鳞癌细胞增殖及凋亡的影响△

王亚平 邱雁君 李玲香 崔晓波 张莉 胡文良 贺利平

TANK结合激酶1(TANK binding kinase 1，TBK1)是Ⅰ型干扰素合成过程中最为关键的蛋白激酶，主要是在由细菌引起的或者是由病毒引起的固有免疫途径中发挥重要作用。人体的几乎所有组织中，包括皮肤、脑、肝脏、脾脏、胃、小肠、心脏、胸腺、肺、肾脏等组织和器官，TANK结合激酶1都有较为稳定且广泛的表达[1]。有研究显示TBK1与机体的细胞自噬以及恶性肿瘤的发生发展具有显著的相关性[2,3]。有关TBK1与多种恶性肿瘤的发生发展相关性的研究显示，TBK1在肿瘤组织中的蛋白表达水平往往高于其在正常对照组织中的表达[4～6]；已有前期的研究显示，TBK1在头颈部鳞癌细胞的表达高于其在正常组织中的表达，在头颈部肿瘤的早期诊断和治疗上具有积极的意义。本课题组前期研究中，通过GEO大数据等系统分析，发现TBK1表达异常可能与头颈鳞癌状细胞增殖及凋亡改变有相关性[7]；转染靶基因siRNA是目前常用的基因靶向抑制的方法，本研究采用转染TBK1-siRNA的方法对舌及下咽鳞癌细胞FaDu及Cal-27的TBK1基因进行靶向干预，以进行后续研究；此外，氨来呫诺(amlexanox)是一种特异性的TBK1 抑制剂[8]，可以调节免疫反应并具有抗炎作用[9]，本研究采用氨来呫诺梯度浓度处理后观察其对FaDu及Cal-27细胞增殖的影响，进一步探讨靶向抑制TBK1基因后对舌部、咽部肿瘤中鳞状细胞增殖与凋亡水平影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂 本研究所采用的人咽鳞癌细胞系FaDu以及人舌鳞癌细胞系Cal-27均由武汉大学人民医院耳鼻咽喉头颈外科研究所保种，采用DMEM高糖培养基，10%胎牛血清，37 ℃，5%CO2条件下培养。TBK1-siRNA购买于广州市锐博生物科技有限公司(Ribo Bio Co Ltd，Guangzhou, China，公司官方网址为http: //www.ribobio.com)，转染试剂Lipofectamine TM 2000，购于上海碧云天生物技术有限公司(Beyotime Bio Co Ltd，Shanghai, China，公司官方网址为http: //www.beyotime.com)，TBK1抑制剂氨来呫诺购买于MCE(MedChemExpress Co Ltd，NJ，USA，公司官方网址为https://www.medchemexpress.cn)。

1.2方法

1.2.1蛋白质印迹实验 为了研究舌及下咽鳞癌细胞中TBK1的表达改变是否会对细胞增殖、凋亡等生物学行为产生影响，采用TBK1-siRNA转染舌及下咽鳞癌细胞FaDu、Cal-27，对舌及下咽鳞癌细胞FaDu、Cal-27细胞的TBK1蛋白表达进行靶向抑制，转染后采用蛋白质印迹实验检测TBK1蛋白表达抑制的情况，实验分组：FaDu、FaDu/siCTRL、FaDu/siTBK1、Cal-27、Cal-27/siCTRL、Cal-27/siTBK1。将处在对数生长期的细胞，提取各组细胞的总蛋白后进行蛋白印迹实验，将蛋白样品通过电泳和电转到PVDF膜上，用封闭液封闭2 h后敷上一抗(GAPDH、TBK1)，4 ℃孵育过夜，用TBST清洗三遍后将膜敷二抗1 h，最后用Oddesy的增强化学荧光扫描膜上的蛋白，使用Oddesy软件分析其谱带强度。

1.2.2流式细胞术实验 为了研究舌及下咽鳞癌细胞中TBK1的表达改变是否会对细胞凋亡产生影响，用TBK1-siRNA转染舌及下咽鳞癌细胞FaDu、Cal-27后，采用流式细胞术检测细胞凋亡改变。实验分组：FaDu、FaDu/siCTRL、FaDu/siTBK1、Cal-27、Cal-27/siCTRL、Cal-27/siTBK1。将处于对数生长期的细胞接种于6孔板培养24 h后，收集细胞，包括上清和贴壁的细胞，用PBS清洗两次后固定细胞，然后分别加入5 μL的FITC和10 μL的PI染色，最后用流式细胞仪检测细胞的凋亡，可被FITC/PI染色的为凋亡细胞。

1.2.3细胞增殖实验 为了研究舌及下咽鳞癌细胞中TBK1的表达改变是否会对细胞增殖产生影响，采用CCK-8法检测梯度浓度氨来呫诺处理的FaDu及Cal-27细胞增殖改变。将处在对数生长期细胞，采用梯度浓度(0、100、300、500 μM)氨来呫诺处理，分别以每孔1×103个细胞种植到96孔板中，将10 μL/孔的CCK-8加到96孔板中，37 ℃着色1h后，使用酶标仪在450 nm波长下测定光密度值(OD值)，并记录数据。对细胞活性的影响用测定细胞活性的OD值比上对照组细胞的OD值的百分比来表示，并计算其IC50。

1.2.4克隆形成实验 为了进一步验证舌及下咽鳞癌细胞中TBK1的表达改变是否会对细胞增殖产生影响，用克隆形成实验对梯度浓度氨来呫诺处理的舌及下咽鳞癌细胞FaDu、Cal-27的增殖改变进行检测，从不同于靶向干扰TBK1表达的角度去验证TBK1在舌及下咽鳞癌细胞增殖中的作用。取对数生长期细胞，采用梯度浓度(0、100、300、500 μM)氨来呫诺处理24 h后，消化并吹打成单个细胞，制备细胞悬液接种于培养皿中。置37 ℃，5% CO2环境下静置培养2周。终止培养后弃去上清，用PBS小心浸洗2次，加1∶3醋酸/甲醇5 ml固定15分钟。然后去固定液，加适量Giemsa应用染色液染15分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。

1.3统计学方法 实验数据采用SPSS17.0软件进行统计学分析，均为独立重复三次后取均值，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1靶向抑制FaDu及Cal-27细胞中TBK1蛋白表达检测结果 TBK1-siRNA转染舌及下咽鳞癌细胞FaDu、Cal-27后，转染后提取各组细胞总蛋白进行Western Blot检测，实验结果如图1所示，转染TBK1-siRNA以后，FaDu以及Cal-27的TBK1蛋白表达水平较转染对照组及未转染组明显下降(P<0.05)。

图1 Western Blot检测靶向抑制FaDu、Cal-27细胞中TBK1蛋白表达 a. FaDu及Cal-27在转染了抑制细胞中TBK1蛋白表达的siRNA前后,TBK1蛋白表达的Western Blot结果;b. FaDu及Cal-27在转染了抑制细胞中TBK1蛋白表达的siRNA前后,TBK1蛋白表达情况的数据比较(P<0.05)

2.2靶向抑制FaDu及Cal-27细胞中TBK1蛋白表达后细胞凋亡检测结果 采用流式细胞术分别检测TBK1-siRNA转染FaDu及Cal-27细胞的凋亡改变，将其与转染对照组及未转染组细胞的凋亡进行对比，结果显示，与转染对照组与未转染组相比较，TBK1-siRNA转染组中FaDu及Cal-27细胞凋亡显著增加，差异有显著统计学意义(P<0.05)(图2、3)。

图2 抑制了TBK1的蛋白表达后FaDu下咽鳞癌细胞凋亡流式细胞术检测结果 a～c.靶向抑制FaDu细胞中的TBK1蛋白表达的siRNA后,FaDu细胞凋亡显著的增加;d. 数据统计分析结果显示,靶向抑制细胞中的TBK1后,FaDu细胞凋亡显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)

图3 抑制了TBK1的蛋白表达后Cal-27舌鳞癌细胞凋亡流式细胞术检测结果 a～c.靶向抑制细胞中的TBK1后,Cal-27细胞凋亡得到了显著的增加;d. 数据统计分析结果显示,靶向抑制TBK1后,Cal-27细胞凋亡显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)

2.3TBK1蛋白抑制后FaDu及Cal-27细胞增殖能力检测结果 采用梯度浓度氨来呫诺处理舌及下咽鳞癌细胞，进行克隆形成以及细胞增殖(CCK-8法)实验观察其对舌及下咽鳞癌细胞增殖能力的影响，克隆形成实验结果显示，随着氨来占诺浓度增加，FaDu及Cal-27细胞系的克隆形成能力显著下降(图4)；CCK-8法检测显示，随着氨来占诺浓度增高，FaDu及Cal-27细胞的增殖能力显著下降(P<0.05)(图5)。

图4 克隆形成实验结果 随着氨来占诺浓度增加,FaDu及Cal-27的克隆形成能力显著下降

图5 CCK-8法实验结果 抑制了TBK1的蛋白表达以后,FaDu及Cal-27细胞增殖能力显著下降

3 讨论

头颈部恶性肿瘤大约占全身恶性肿瘤的百分之十，其中绝大多数都是鳞状细胞癌[10]，其发病机制以及转归的研究一直是头颈肿瘤研究领域的重点和难点。关于鳞状细胞癌肿瘤标志物的研究有很多，包括P63[11,12]、CK 5/6[13,14]以及P 40[15]等，很早以前就开始在临床有所应用，但是这些研究以及应用，大部分都是集中在乳腺癌或肺癌；而这些鳞癌标志物在舌部、咽部鳞癌中的研究及应用较少。因此，探讨头颈部鳞癌特异性肿瘤标志物及靶向治疗十分必要。

越来越多的研究表明，TBK1与多种恶性肿瘤的发生发展有关，尤其是与乳腺癌、非小细胞肺癌等具有显著的相关性[16,17]，并且TBK1在肿瘤组织中的蛋白表达水平常常比对照组高。一项有关膀胱癌与TBK1相关性的研究发现，TBK1蛋白在膀胱癌肿瘤组织中高表达，而且在敲除了TBK1基因以后，膀胱癌肿瘤细胞的增殖和转移也受到了显著的抑制[5]，这种情况在其他的肿瘤中也有发现[18]；Liu等[19]发现在骨肉瘤中，TBK1的蛋白表达水平升高，而mir-203可以通过对TBK1的蛋白表达进行抑制，从而影响骨肉瘤患者的预后。Wei等[3]发现在乳腺癌中TBK1蛋白的高表达与乳腺癌的复发具有显著的相关性。因此，在抑制了TBK1蛋白表达之后，会对头颈部鳞癌细胞产生什么影响，十分值得研究。

本研究首先采用了转染TBK1-siRNA的方法靶向抑制TBK1的表达，结果显示在抑制了TBK1的蛋白表达以后，FaDu及Cal-27细胞凋亡都显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，说明TBK1或许是头颈部鳞癌潜在的靶向治疗目标之一。一项有关肺癌的研究结果显示，TBK1也是一种有丝分裂调节器，TBK1基因的敲除可以使异粘蛋白的磷酸化减少，从而对肿瘤细胞的生长进行抑制，并且同时促进肿瘤细胞的凋亡[20]，本研究结果与此类似。为了进一步说明TBK1在舌及下咽鳞癌细胞增殖调控中的作用，本研究还采用TBK1抑制剂氨来呫诺进行了实验，梯度浓度的氨来呫诺处理头颈鳞癌细胞后，采用CCK-8法及克隆形成实验检测其对增殖的影响，结果提示随着氨来呫诺的浓度增加，FaDu及Cal-27细胞增殖都受到了显著的抑制，差异有统计学意义(P<0.05)。

综上所述，对TBK1蛋白表达进行抑制以后，舌及下咽部鳞癌细胞的增殖能力明显降低，细胞凋亡显著增加，提示TBK1的表达在舌及下咽部鳞癌细胞的增殖中发挥重要作用，药物氨来呫诺作用后可以明显抑制舌及下咽鳞癌细胞的克隆形成能力。