乳酸杆菌产胞外多糖培养条件的优化

宋昊芮，李 彦，王 乐，姚一帆

(长沙理工大学化学与食品工程学院，湖南 长沙 410114)

乳酸杆菌分泌到胞外的糖类化合物EPS，为粘液多糖和荚膜多糖.EPS在食品加工中可用于增稠、稳定、乳化及制成保健药物抑制癌症. 影响EPS产量的内因是种属,外因包括培养基的葡萄糖含量、初始pH值、培养温度等，国内外已有许多相关研究和结论,因菌株种类不同有所差别.本实验是从自制泡菜汁中提取乳杆菌经，经生化鉴定确认其细菌菌属，再从乳杆菌中提取EPS并用苯酚-硫酸法进行多糖含量测定，并采用单因素法对LAB EPS产量影响因素进行初步探究，然后设计四因素三水平(温度、pH值和葡萄糖含量、时间)正交试验，最终确定菌株获得高产胞外多糖的最佳实验条件组合.

1 材料与方法

1.1 材料与设备

原材料：果蔬；白糖；白醋；食盐.

仪器：电子天平(TD6002B)；电子分析天平(BSA124S)；紫外可见分光光度计(UV-5200)；METASH微量高速离心机(TG16-W)；立式压力蒸汽灭菌器(DY04-13-44-00)；恒温培养箱(DPX-9052B-2)；生化培养箱(LRH-250)；显微镜(BM1000)；pH计(DELTA320)；双人双面垂直净化工作台(SW-CJ-2FD)；万用电炉(DL-1).

1.2 实验方法

1.2.1 制作泡菜 泡菜腌制汁由凉白开水3 000 mL，加白糖80.0 g、白醋100.0 g、食盐30.0 g，常温配制.泡菜原料为黄瓜100 g，白萝卜100 g，长豆角100 g，蒜11.93 g，辣椒5.86 g.泡菜原料倒入泡菜坛，注入泡菜汁约400～450 mL(距坛口1 cm左右，保证兼性厌氧乳酸杆菌的生长)，保鲜膜封口，蒸馏水液封于常温避光干燥处7～10 d.

1.2.2 乳酸杆菌的分离纯化 将腌后泡菜汁吸取1 mL接种到MRS液体培养基上，于培养箱37 ℃静置培育过夜.吸取1.0 mL样品液稀释10-6，10-7，10-83个稀释度后，分别于含1% CaCO3的固体MRS培养基涂平板上，每个梯度进行3组平行和1组空白实验，恒温37 ℃培养24～48 h.挑取菌落为白色且四周有分散现象、表面粘稠、产生乳酸菌溶解圈等具有乳酸菌典型特征的圆形明显的单株菌落，平板划线分离纯化后接种到MRS固体斜面上，置于4 ℃冰箱中保存.革兰氏染色阳性、V-P试验阳性、明胶液化试验和硝酸盐还原试验阴性且接触酶试验与葡萄糖发酵试验不产气泡并能凝乳的菌株认定为乳酸菌.

1.2.3 乳酸杆菌胞外多糖提取 取5 mL乳杆菌发酵液于试管，加80%(体积分数)的三氯乙酸100 μL，脱除蛋白质，10 000 r/min冷冻离心15 min除菌体，上清液倒入透析袋流水透析48 h.透析液入试管，加95%的无水乙醇(比例为1∶3)，于4 ℃冰箱静置过夜，得絮状沉淀.低温4 ℃，10 000 rad/min离心15 min，倒掉上清液，得白色沉淀即为胞外多糖.

图1 葡萄糖标准曲线Fig. 1 Standard Curve of Glucose

1.2.4 乳杆菌EPS的测定 乳酸菌胞外多糖含量用葡萄糖作标准曲线，采用苯酚-硫酸法测定.取乳杆菌发酵液10 mL， 加三氯乙酸离心除蛋白质.上清液装入透析袋中透析，加2～3倍体积的95%乙醇于透析液中用来沉淀多糖，离心得沉淀溶于蒸馏水，即得水溶性乳酸菌胞外多糖.乳酸菌胞外多糖水溶液在490 nm处的吸光度用苯酚-硫酸法测得， 对应的糖含量在标准曲线上查找，即得乳酸菌的胞外多糖产量.胞外多糖含量(%)=((待测液质量浓度×250)/(样品质量×103))×100%.

1.2.5 乳杆菌胞外多糖发酵条件优化 选取不同培养温度、不同葡萄糖含量、不同培养基pH值、不同培养时间为影响因素进行实验，根据糖量多少选择最佳培养条件.葡萄糖标准曲线如图1所示.

1.2.6 单因素影响试验 (1)温度的影响.不同培养温度对乳酸杆菌产胞外多糖的影响如图2所示.

由图2可知，从10 ℃开始，乳酸杆菌产胞外多糖呈线性增加，至37 ℃时达到峰值，培养温度继续上升产胞外多糖呈下降趋势.

(2)pH值的影响.不同pH值对乳酸杆菌产胞外多糖的影响如图3所示.

由图3可知，培养pH值为3～9，在pH值为6时乳酸杆菌产胞外多糖达到峰值，随后下降.

图2 不同温度EPS生长曲线Fig. 2 EPS Growth Curves at Different Temperatures

图3 不同pH值EPS的生长曲线Fig. 3 EPS Growth Curves with Different pH

(3)培养时间的影响.不同培养时间对乳酸杆菌产胞外多糖的影响如图4所示.

由图4可知，培养时间为10 h时，乳酸杆菌产胞外多糖达到峰值，随后趋向于动态平衡.

(4)葡萄糖含量的影响.葡萄糖含量对乳酸杆菌产胞外多糖的影响如图5所示.

由图5可知，葡萄糖含量为1.5%时，乳酸杆菌产胞外多糖达到峰值.

图4 不同培育时间EPS生长曲线Fig. 4 EPS Growth Curve at Different Times

图5 不同葡萄糖含量EPS生长曲线Fig. 5 EPS Growth Curves with Different Glucose Content

1.2.7 正交试验 设计培养温度、葡萄糖含量、培养基pH值、培养时间的正交试验，4因素3水平正交试验表见表1.

表1 影响EPS产量因素的正交试验设计

根据表1设定的3个水平，测定每组的EPS吸光度值，将试验结果输入软件进行分析.

2 结果与讨论

正交试验结果列于表2.

表2 发酵条件优化分析

由表2可知，各因素影响的大小顺序依次为温度、pH值、时间、葡萄糖含量.对LAB的EPS产量影响最大为培养温度，培养基中养分葡萄糖含量对EPS产量几乎无影响.A2B2C3D1的组合培养条件是产量最高的发酵条件，即乳酸杆菌高产EPS的最适宜工艺条件为：温度35 ℃，葡萄糖质量分数1.5%，pH值6.5，发酵时间10 h.

笔者探究了温度、pH值、时间、葡萄糖含量4种因素对乳酸杆菌胞外多糖产量的影响，当然菌株的生长不仅跟这些因素有关，还跟培养基中碳和氮的比例等条件有关，因此需有待进一步研究.