桑白皮药材的品质检测及质量标准

刘一涵，田云刚，郭洪伟，王建霞，魏 华，2

(1.吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000；2. 湖南省土家医药研究中心，湖南 吉首 416000)

桑白皮始载于《神农本草经》，原名桑根白皮，古代称桑皮、桑根皮、白桑皮，按现代的产地命名有“亳桑皮”(亳州)、“严桑皮”(浙江)、“北桑皮”(江苏).据史料考证，桑白皮原植物除了桑MorusalbaL.以外，还有蒙桑M.mongolic、华桑M.cathayana和鸡桑M.australis.2015年版中国药典收录的桑白皮为桑科植物桑MorusalbaL.的干燥根皮[1].桑白皮性寒，味甘，归肺经，具有泻肺平喘、利水消肿之功，主治肺热喘咳、水肿胀满尿少、面目肌肤浮肿之症[1].现代药理学研究表明，桑白皮具有平喘[2]、降血压和血脂[3-4]、抗抑郁[5]、抗炎抗肿瘤[6-7]、镇痛[8]、抗酪氨酸酶[9]、抗病毒[10]等活性，极具开发利用价值.

桑白皮作为一种常用中药，由于其原植物桑栽培广泛，人工杂交的品种繁多，导致市售品中，常有伪品、次品混入.同时，2015年版中国药典中仅有桑白皮的传统鉴别和薄层鉴别，这很难满足全面控制药材质量的要求.因此，制定新的桑白皮药材质量标准刻不容缓.近年来，有关桑白皮药材的研究多集中在其化学成分和药理作用方面，对药材的水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物及适宜性薄层鉴别等的研究少之又少.为此，笔者采集并处理得到来自7个省的85批有确定产地及生源的桑白皮，对其水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物及薄层鉴别等方面进行了研究，同时，以桑皮苷A为指标性成分进行定量测定，建立了相应的标准，并对不同产地、不同生源的桑白皮进行了差异评价,以期为桑白皮的生产、筛选及新的桑白皮药材标准制定提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 仪器、样品与试药

仪器.CAMAG SANMPLER 4型全自动点样仪，配置25 μL点样针；CAMAG ADC 2自动展开仪；CAMAG VISUALIZER薄层成像仪(瑞士卡玛公司)；岛津LC16型高效液相色谱(岛津公司)；LE204E/02万分之一天平(瑞士METTLER TOLEDO)；WJX-800A多功能粉碎机(上海缘沃工贸有限公司)；101-2AB电热鼓风干燥箱(北京中兴伟业仪器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循环式多用真空泵(上海力辰邦西仪器科技有限公司)；KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；20X1 CHIGO电陶炉(中山市顺邦电器有限公司)；L530医用离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；DZKW-D-6电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)；SX-2.5-10箱式电阻炉，KSW-6-12电炉温度控制器(邦西仪器科技有限公司)；硅胶GF254预制板(青岛海洋化工厂).

样品.85批鲜桑树根于2017年10—11月采挖所得.不同来源的桑树根分别收集于安徽、广东、江苏、湖南、河南、四川、浙江等地，各批次样品植物标本经吉首大学张代贵教授鉴定为桑科植物桑 (MorusalbaL.).各批鲜根置于通风处，抖净泥土，用铜刀刮去根最外层粗皮(栓皮层)，刮皮时尽量减少浆液损失，将里层白皮剥下(难剥下的用槐木锤在槐木板上轻轻敲打剥下)，再用不锈钢切片机切成0.5～1 cm的小段，45 ℃烘干后得桑白皮，保存备用.

试剂与材料.甲醇(色谱纯和分析纯)；二氯甲烷(分析纯)；乙酸乙酯(分析纯)；盐酸(分析纯)；95%乙醇(分析纯)；石油醚(分析纯)；硝酸银(分析纯)；冰乙酸(色谱纯)；；怡宝水；桑皮苷A标准品(成都克洛玛生物科技有限公司)；桑辛素、桑酮G标准品(实验室自制，纯度达98%以上).

1.2 方法

1.2.1 桑皮苷A的薄层鉴别 供试品溶液的制备：称取过二号筛的样品粉末约0.5 g，置具塞锥形瓶中，加入50 mL 70%甲醇，加热回流40 min，放冷，过滤，滤液作为供试品溶液.

标准品溶液的制备：精密称定桑皮苷A标准品5.0 mg，加甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶，制成质量浓度为0.2 g/L的标准品溶液.

TLC实验：吸取供试品和标准品溶液各3～6 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-冰乙酸(1∶6∶2.5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视.

1.2.2 桑辛素和桑酮G的薄层鉴别 供试品溶液的制备：称取过二号筛的样品粉末0.1 g，加25 mL 95%乙醇，超声(100 W，40 kHz)处理30 min，离心，取上清液作为供试品溶液.

标准品溶液的制备：取桑辛素、桑酮G标准品，加95%乙醇制成二者质量浓度均为0.1 g/L的混合溶液，作为标准品溶液.

TLC实验：吸取上述2种溶液各10～15 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚-二氯甲烷-甲醇-冰乙酸(5∶10∶1.2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254 nm)下检视.

1.2.3 水分、总灰分及酸不溶性灰分测定[11]参照2015年版中国药典第四部通则0832水分测定法第二法(烘干法)测定水分，参照通则2302下总灰分测定法测定总灰分，参照通则2302下酸不溶性灰分测定法测定酸不溶性灰分.

1.2.4 浸出物提取条件考察及含量测定 取X1样品粉末，参照2015年版中国药典第四部通则2201水溶性浸出物测定法[11]，考察热浸法和冷浸法以及分别以体积分数为0，20%，40%，60%，80%，95%的乙醇作为提取溶剂时提取的浸出物含量差异.以浸出物含量最高的提取方法提取和测定各样品中浸出物.

1.2.5 HPLC测定桑皮苷A含量 标准品溶液的制备：精密称取5.5 mg桑皮苷A标准品于10 mL的容量瓶中，加7%甲醇溶解并定容，配成质量浓度为550 mg/L的标准品溶液，备用.

供试品溶液的制备：精密称取过二号筛的500.0 mg桑白皮粉末于150 mL具塞锥形瓶中，加入50 mL确70%甲醇，精密称定后于80 ℃水浴回流提取40 min，冷却称重，并用70%甲醇补足减失的重量，4 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL于10 mL容量瓶中，用纯净水定容至刻度，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得.

色谱条件：YMC-Pack ODS-A(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量20 μL，检测波长326 nm，流动相5%甲醇(A)∶甲醇(B)，梯度洗脱(0～40 min,10%B;40～41 min,10%～100%B;41～50 min,100%B; 50～51 min,100%～10%B;51～60 min,10%B).在此条件下，桑皮苷A与相邻色谱峰的分离度大于1.5，按桑皮苷A计算，理论塔板数>5 000.标准品及供试品的部分HPLC图谱见图1.

图1 桑皮苷A标准品(A)和桑白皮供试品HPLC色谱图(B)Fig. 1 HPLC Chromatograms of Mulberroside A Standard (A) and Sample (B)

线性关系考察：精密吸取桑皮苷A标准品溶液，用7%甲醇依次稀释配制得质量浓度分别为550，330，220，110，5.5，2.75 mg/L的桑白皮苷A标准品溶液.0.45 μm微孔滤膜过滤，按1.2.5节色谱条件测定，以标准品质量浓度为纵坐标(X)，峰面积为横坐标(Y)，进行线性回归.

检测限和定量限：按信噪比(S/N)约为3的标准品溶液质量浓度为检测限(LOD)，以信噪比(S/N)约为10的标准品溶液质量浓度为定量限(LOQ).

精密度试验：按1.2.5节色谱条件对质量浓度为100 mg/L标准品溶液连续进样6次，计算6次桑皮苷A峰面积的RSD值.

稳定性试验：按1.2.5节色谱条件对同一桑白皮(S16)供试品溶液分别于0，4，8，12，24，28，32，36，40，44，48 h进行分析，计算48 h内桑皮苷A峰面积RSD值.

重复性试验：取同一批过二号筛的桑白皮(S16)粉末0.5 g，精密称定6份，按1.2.2节方法制备供试品溶液，按1.2.5节色谱条件进行测定.计算6次重复试验的桑皮苷A峰面积RSD值.

加样回收实验：精密称定已知含量的桑白皮样品(编号X6，已知X6中桑皮苷A质量分数为0.74%)6份，每份均为0.25 g，分别置250 mL锥形瓶中，然后分别加入桑皮苷A标准品溶液(质量浓度为0.6 g/L)3.0 mL，按1.2.2节的方法制备供试品溶液，按1.2.5节色谱条件测定，计算回收率.

样品含量测定：分别称取过二号筛的各批桑白皮药材粉末0.5 g，按1.2.2节方法制备供试品溶液，按1.2.5节的色谱条件进行测定，用外标法计算各批桑白皮中桑皮苷A的含量.

2 结果

2.1 薄层鉴别结果

桑皮苷A薄层鉴别结果如图2所示.以桑皮苷A为标准品，置紫外光灯365 nm下检视，桑白皮供试品色谱在与标准品相应的位置上，显现相同颜色的荧光斑点，Rf≈ 0.5，且斑点清晰，分离度较好.桑辛素和桑酮G的薄层鉴别结果如图3所示.以桑辛素和桑酮G为标准品，254 nm下检视，桑白皮供试品色谱在与2个标准品色谱相应的位置上，显现2个相同的荧光斑点，桑辛素斑点Rf≈ 0.8，桑酮G斑点Rf≈0.1，分离度较好.

图2 部分样品中桑皮苷A薄层色谱图(365 nm)Fig. 2 TLC of Mulberroside A in some Samples (365 nm)

图3 部分样品中桑辛素、桑酮G薄层色谱图(254 nm)Fig. 3 TLC of Morusin and Kuwanon G in some Samples (254 nm)

2.2 水分、灰分、酸不溶性灰分和浸出物测定结果

85批桑白皮药材水分、总灰分、酸不溶性灰分及浸出物测定结果见表1.结果表明：85批药材中，水分质量分数为6.38%～10.78%，平均8.21%，药材均无生虫或发霉现象；总灰分质量分数为3.42%～16.68%，平均7.58%；酸不溶性灰分质量分数为0.01%～9.12%，平均1.97%.酸不溶性灰分质量分数最大值与最小值相差较大，这可能与药材前处理时带入了少量泥土、尘沙等无极杂质有关.比较不同乙醇和不同提取方法对浸出物的影响结果，发现以水为溶剂、热浸法提取的浸出物最多.热浸法所得的水溶性浸出物质量分数为19.36%～40.57%，平均31.61%.

表1 桑白皮药材信息及各批样品各项质量分数测定结果

表1(续)

表1(续)

2.3 桑皮苷A测定结果

桑皮苷A回归方程为Y=43 210X-285 404，r=0.999 8.结果显示桑皮苷A标准品质量浓度在2.75～550 mg/L之间线性关系良好.桑皮苷A检测限为0.06 mg/L，定量限为0.17 mg/L.精密度测定的RSD为0.903%，说明仪器精密度良好.稳定性测定的RSD为1.829%,表明供试品在48 h时间内稳定性良好.方法重复性测定的RSD为1.998%，表明此方法重复性良好.加样回收率结果见表2.结果表明,平均回收率为101.35%，RSD为1.67%.以上结果RSD均小于2%，说明此方法可用于桑白皮中桑皮苷A的含量测定.HPLC测定的各批药材中桑皮苷A质量分数为0.72%～10.50%，平均2.00%.

表2 桑皮苷A的加样回收率试验(n=6)

2.4 不同生源桑白皮药材结果分析

不同生境桑白皮各测定指标平均值见表3.85批桑白皮药材中有53批为野生，32批为栽培.整体比较野生桑白皮和栽培桑白皮的各测定指标平均值，发现栽培桑白皮中的水分、酸不溶性灰分及水溶性浸出物含量均高于野生桑白皮，野生桑白皮中总灰分和桑皮苷A含量略高于栽培桑白皮.

表3 不同生境桑白皮各各测定指标平均值

2.5 不同产地桑白皮药材结果分析

不同产地桑白皮各测定指标平均值见表4.7个省份桑白皮的各测定指标平均值中，水分含量最高的是广东桑白皮(9.52%)，最低的是河南桑白皮(7.69%)；总灰分含量最高的是河南桑白皮(8.05%)，最低的是广东桑白皮(5.72%)；酸不溶性灰分含量最高的是河南桑白皮(2.58%)，最低的是广东桑白皮(1.12%)；浸出物含量最高的是广东桑白皮(36.94%),最低的是浙江桑白皮(26.45%).桑皮苷A含量最高的是江苏桑白皮，四川桑白皮次之，若以桑皮苷A为指标采集桑白皮，此二省可作为首选之地.

表4 不同产地桑白皮各测定指标平均值

3 结语

2015年版中国药典中已有的桑白皮薄层鉴别法是以对照药材作为定性比照，且操作方法较为复杂.实验结果表明，笔者所使用的薄层色谱方法可检出桑白皮中桑皮苷A、桑辛素和桑酮G 3种成分，斑点清晰且操作简便、快速，可作为桑白皮药材的定性鉴别方法.

药材含水量过高或过低都可导致其发生虫害、霉变、潮解、软化、风化、走味或其他质变[12].总灰分代表中药材矿物质或杂质,酸不溶性灰分代表中药材中的泥沙或微量氧化硅,浸出物可充分反应药材的内在质量. 各指标性成分是中药材药效质量的重要保证，直接影响药材有效成分，从而影响其临床疗效.这些指标可作为中药材质量控制指标. 2015年版中国药典中缺乏桑白皮质量检测指标及其控制标准，同时，笔者未见国内关于桑白皮药材的水分、灰分和浸出物测定的文献报道.本文首次使用药典法对桑白皮药材品质进行检测，结果表明，不同批次桑白皮药材差异较大，综合分析，应为桑白皮产地、生长环境及生长期限等因素所导致.因此，在质量标准中设定各检测指标限度可直接影响药材质量及供求关系，适度的标准可在控制药材质量的同时，充分利用药材资源.

笔者除了考察文中新采集的85批桑白皮药材的水分以外，还另外检测了2013—2016年的6批桑白皮药材，发现含水7.06%～12.26%，均未出现霉变情况.因此，建议桑白皮水分含量以质量分数不超过13%为宜.按不超过测定平均值的120%的限度[13]，建议桑白皮总灰分质量分数不超过9.0%，酸不溶性灰分质量分数不超过2.5%.按不低于测定平均值的80%限度[13]，建议桑白皮水溶性浸出物质量分数不低于25%.按合格品桑皮苷A不低于80%限度[13]，建议桑白皮中桑皮苷A物质量分数不低于0.91%.