调经丸的质量标准研究

陆 颖，王玉龙，何 越

（南京中医药大学附属盐城市中医院，江苏 盐城 224000）

月经失调是现代女性中多见的妇科病，表现为月经周期的紊乱或出血量的异常，同时可能出现月经前、经期时的腹痛及全身症状[1]。现在西医学在月经不调的治疗方法上以使用雌孕激素来调节月经周期以及促进排卵为主[2]，虽然短期内效果明显，但是副作用大，且停药后病情可能会复发。中医在月经不调的治疗注重整体观念，审因论治，根据患者经期时的实际情况分析，制定合理的治疗方案，针对病因以内服中药配合针灸等方法调整周期。本院针对此病机确立了补气健脾、养血调经的治法，精选处方，研制了医院制剂“调经丸”，主要功效为理气和血，调经止痛。临床研究显示，与西药（如黄体酮）相比，本制剂兼顾病因、病症，标本兼治，疗效突出，副作用小，无明显毒副作用，有很大的应用前景。

1 实验材料与仪器

1.1 药品与试剂

3批调经丸样品（批号：20160116、20160803、20170110；盐城市中医院）；阿魏酸对照品（批号：110773-201614；中国食品药品检定研究院）；丹参酮LlA对照品（批号：110766-201520；中国食品药品检定研究院）；黄芪甲苷对照品（批号：110781-201515；中国食品药品检定研究院）；试验中用到的试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

紫外分析仪3650A；薄层色谱摄像仪；FW177型中草药粉碎机；BP211D型分析天平；KQ-500型超声波清洗器。

2 实验方法

2.1 调节丸中活性成分的薄层色谱鉴别

2.1.1 当归的薄层鉴别[2-3]

2.1.1.1 供试品的制备

用研钵对调经丸进行研磨，再使用精确到0.01 g的电子天平称取调经丸细粉2 g，将其倒入锥形瓶中，加水10 mL使其溶解，再加入乙醇40 mL，用玻璃棒搅拌均匀。将溶液倒入蒸发皿中，用水浴锅加热使乙醇挥发，浓缩到15 mL左右，倒入分液漏斗中，用蒸馏水荡洗蒸发皿，洗涤液倒入分液漏斗中。用15 mL乙醚提取溶液中的有效成分，提取两次，将上述提取所得的两次乙醚液放置同一容器中，再加入2% Na2CO3溶液振摇萃取2次，一次加入15 mL，将乙醚层倒掉，在提取液滴加适量Hcl溶液调整pH值至2-3，用少量苯萃取，倒掉苯液，再用乙醚充分摇匀萃取2次，分别使用30 mL，将2次萃取的乙醚液混合，将上述提取所得的两次乙醚液放置同一蒸发皿中，并且置于水浴锅上挥干溶剂，挥干后所得残留物中加乙醇溶解，作为供试品溶液。

2.1.1.2 对照品的制备

对照品溶液：使用精确到0.01 g的电子天平称量当归对照药材3 g，置于磨口锥形瓶中，使用移液管精密量取100 mL蒸馏水加入容器中，浸泡1 h后，装上回流装置，进行加热回流，回流以保持溶液微沸状态最佳，加热回流溶液1 h；再用干燥的过滤器进行滤过，将滤液接于适宜大小的蒸发皿中，放在水浴锅上加热浓缩至10 mL，用15 mL乙醚提取溶液中的有效成分，提取两次，将两次萃取的乙醚液混合，放置同一蒸发皿中，并且置于水浴锅上挥干溶剂，向蒸干后所得的残留物中加入乙醇1～2 mL使其溶解，即得对照药材溶液。

阴性对照品溶液：按本品处方比例称取除当归外的各药材,按本品制备工艺制备缺当归的阴性对照样品,按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

阿魏酸对照品溶液：使用分析天平精密称定阿魏酸对照品10.0038 mg，用移液管精密量取甲醇溶液5 mL，将对照品溶解，配制浓度为2.0019 mg/mL的对照溶液（选用棕色容量瓶且放入冰箱冷藏待用）。

2.1.1.3 展开条件

点样体积：5～10 μL；硅胶板：硅胶G板；展开剂：以20：1：3的比例，称取完全饱和苯20 mL、冰醋酸1 mL及甲醇3 mL溶液，于烧杯中混合配制成展开剂，点样前提前20分钟将展开剂倒入展开缸中，使展开缸饱和；紫外光灯检测波长：365 nm；展距：10 cm。

2.1.2 丹参的薄层鉴别[8-9]

2.1.2.1 供试品溶液的制备

用研钵对调经丸进行研磨，再使用精确到0.01 g的电子天平称取调经丸细粉2 g，将其倒入磨砂口锥形瓶中，向锥形瓶中加入甲醇30 mL，用玻璃棒搅拌均匀，超声处理0.5 h。再用干燥的过滤器进行滤过，放置同一蒸发皿中，并置于水浴锅上将甲醇蒸干。挥干后再向蒸发皿中加水20 mL溶解残留物，溶液倒入分液漏斗中，使用20 mL乙醚进行萃取，前后三次，将提取的乙醚层混合，倒入同一蒸发皿中，并在水浴锅上挥干溶剂，向蒸干后所得的残留物中加入乙醇1～2 mL使其溶解，即得供试品溶液。

2.1.2.2 对照品溶液的制备

阴性对照溶液：按照2.1.1.2项下的处理方法制备缺丹参的阴性对照溶液；丹参酮对照品溶液：用分析天平精密称取丹参酮IIa对照品10.0132 mg，加甲醇溶液10 mL使其溶解，制成浓度为1.0132 mg/mL的对照品溶液。

2.1.2.3 薄层色谱条件

点样体积：5～10 μL；硅胶板：硅胶G板；展开剂1：以6:4:8:1:4的比例，称取三氣甲烷12 mL、甲苯8 mL、乙酸乙酯16 mL、甲醇2 mL及甲酸8 mL溶液，于烧杯中混合配制成展开剂，点样前提前20分钟将展开剂倒入展开缸中，使展开缸饱和；展开剂2：以4:1的比例，量取石油醚（60～90°C）16 mL及乙酸乙酯4 mL溶液，于烧杯中混合配制成展开剂，点样前提前20分钟将展开剂倒入展开缸中，使展开缸饱和；紫外光灯检测波长：365 nm；展距8 cm（展开剂1展开）、4 cm（展开剂2展开）。

2.1.3 黄芪的薄层鉴别[10-11]

2.1.3.1 供试品的制备

用研钵对调经丸进行研磨，再使用精确到0.01 g的电子天平称取调经丸细粉2 g，将其倒入锥形瓶中，向锥形瓶中加入蒸馏水20 mL，用玻璃棒搅拌均匀，超声处理0.5 h，再用干燥的过滤器进行滤过，滤过的清液用水饱和的正丁醇萃取3次，分别加入15 mL，将正丁醇层溶液混合，用氨水洗涤3次，分别使用15 mL，取用非氨水层，再用正丁醇饱和的水萃取3次，每一次加入15 mL，取用正丁醇层并混合，倒入同一蒸发皿中，并且置于水浴锅上蒸干溶剂，向蒸干后所得的残留物加入甲醇适量使其溶解，即得供试品溶液。

2.1.3.2 对照品的制备

阴性对照品溶液：按照2.1.1.2项下的处理方法制备缺黄芪的阴性对照品溶液；对照药材溶液：再使用精确到0.01 g的电子天平称取黄芪对照药材3 g，放入250 mL规格的锥形瓶中，用移液管精密量取100 mL蒸馏水加入锥形瓶中，浸泡1 h后，装上回流装置，加热回流，回流以保持溶液微沸状态最佳，加热回流溶液1h；用干燥的过滤器进行过滤，将滤液加热蒸发至20 mL，按2.2.3.1项下的处理方法配得对照药材溶液；甲苷对照品溶液：使用分析天平精密称取黄芪甲苷对照品10.0218 mg，加甲醇10 mL使其溶解，配得浓度为1.0218 mg/mL的对照品溶液。

2.1.3.3 薄层色谱条件

点样体积：5～10 μL；硅胶板：硅胶G板；展开剂：以20：5：1的比例，称取二氯甲烷20 mL、甲醇5 mL及水1 mL溶液，于烧杯中混合配制成展开剂，点样前提前20分钟将展开剂倒入已用氨气饱和完全的展开缸中，使展开缸饱和；紫外光灯检测波长：365 nm；加热温度：105℃；显色剂：10%硫酸乙醇溶液；展距：10 cm。

2.2 调节丸中当归的定量分析[4-5]

当归为伞形科植物当归的根，有活血化瘀、养血调经、镇痛、镇静等功效，也为调经丸中的主要活性成分之一[12]。其中，当归的化学成分大概可以划分为两个主要部分，分别是以藁本内酯为主的挥发油部分和以阿魏酸及多糖为主的水溶性部分[13]。当归中的阿魏酸可以在缺氧的条件下保护心肌活动，主要机制是保护线粒和增加心肌血流量，从而增加心肌的抗缺氧能力[6]。

2.2.1 色谱分离条件

色谱柱：C18；流动相：甲醇-0.083%磷酸（29:71）；流速：1 ml/min；检测波长：316 nm；柱温：30℃。

2.2.2 对照品溶液的配制

使用分析天平精密取阿魏酸对照品（1 1 0 7 7 3-201614批）10.00 mg，将其加入100 mL容量瓶中，以甲醇为溶剂溶解并定容到刻度，制得浓度为0.1 mg/mL的对照品溶液，摇匀放入暗处冷藏待用。

2.2.3 供试品溶液的配制

用研钵对调经丸进行研磨,使用精确到0.0001 g的天平称取称取细粉5 g，，放入150 mL规格的磨口锥形瓶中中，用移液管准确移取70%甲醇50 mL，超声提取0.5 h，用干燥的过滤器进行滤过，溶液放于蒸发皿中，放于水浴锅上体积浓缩至10 mL，选用适宜规格的的细孔滤膜滤过，即得供试品[7]。

2.2.4 线性关系考察

取2.2.2项下制备的阿魏酸对照品溶液，精密吸取对照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL置于10 mL容量瓶中，分别用甲醇定容至刻度，摇匀，制得浓度分别为0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.04 mg/mL的对照品溶液。分别精密吸取上述对照液各10 μL注入高效液相色谱仪，记录不同浓度的阿魏酸对照品的峰面积。以阿魏酸的进样量（μL）作为横坐标，不同浓度对照品的峰面积（A）作为纵坐标，绘制标准曲线并计算其回归方程[8]。

2.2.5 当归中阿魏酸的含量测定

精密吸取2.2.3项下制得的供试品溶液10 μL，分别进3次样，记录峰面积，根据标注曲线计算阿魏酸的含量。

3 结 果

3.1 当归的薄层色谱鉴别

在紫外灯365 nm波长下观察色谱图（如图1）,样品的薄层图谱中,在对照药材和对照品的对应位置上,可看到相同的蓝色荧光斑点，缺当归的阴性对照没有干扰。

3.2 丹参的薄层色谱鉴别

将硅胶板放在紫外光灯（365 nm）下检视。样品的薄层图谱（如图2）中,在与对照药材和对照品的对应位置上,可以看到相同的蓝色荧光斑点，缺丹参的阴性对照没有干扰。

3.3 黄芪的薄层色谱鉴别

在紫外灯365 nm波长下观察色谱图（如图3）,在与对照药材和对照品的对应位置上,均可以看到棕褐色荧光斑点，缺黄芪的阴性对照无干扰。

图1 当归薄层图谱

图2 丹参薄层图谱

图3 黄芪薄层图谱

3.4 调节丸中当归的定量分析

图4中，样品分离状况良好，（其中A图为对照品图谱，B图为样品图谱）。在2.2.4条件下考察的线性关系如图5所示，计算所得回归方程为y=6E+07x+10195，r=0.9998，表明阿魏酸在0.01～0.04 mg/mL的浓度范围内线性关系良好。根据标准曲线计算得出阿魏酸的含量为0.0195 mg/g。

图4 阿魏酸对照品及调经丸色谱图

图5 阿魏酸的回归曲线

4 讨 论

调经丸是由当归、黄芪、党参、炒白术、丹参、益母草、桃仁、红花、制香附、赤芍、川牛膝以上十一味中药材组成的。目前，调经丸现有的质量标准仅有常见的一般检验，如理化鉴别等，缺乏具有特征性的薄层定性鉴别及高效液相色谱定量检验方法[9]，为了有效地控制该制剂的质量，故本科研小组借鉴了现代分析检验技术并对照《中国药典》（2015年版）要求，制定较为完整、专属性强的定量定性检验方法，加强对调经丸质量的稳定性、可控性检测，为医院制剂的良性发展奠定基础[10]。

按照本实验中的TLC方法可明显看到当归、丹参和黄芪的特征斑点，所以，可以用上述方法对当归、丹参和黄芪进行定性鉴别。由HPLC色谱图可以看出，对照品溶液中阿魏酸的出峰时间约为24.733分钟，根据对样品的含量测定试验，计算得出调经丸中阿魏酸的含量为19.95 μg/g。

本实验设计旨在研究和创建调经丸的质量准则。薄层色谱图实验现象表明，本实验中采用的薄层色谱法对于鉴定调经丸中是否含有当归、丹参及黄芪药材，实验中所得结果可靠，方法简便、易于操作、实验重复性高，可以被列入检验调经丸质量标准之一；而使用高效液相色谱法对调经丸中阿魏酸进行定量鉴别的方法，经过对其方法学方面的考察，实验数据证明，实验中建立的检测方法简单、灵敏、快速，符合含量测定的要求。

综上所述，本实验建立的TLC法和HPLC法可以被列入检验及鉴定调经丸的质量的方法之一。但在测定阿魏酸含量时，发现调经丸中的阿魏酸较低，且成分较多，不易分离，可考虑在实验时对样品中的阿魏酸进行提取和富集，以达到减少杂质对实验结果的影响的目的。