微乳TLC应用于疗筋涂膜剂中分离鉴定的对比研究

李得堂， 张丽娟， 唐洪梅*， 蔡庆群， 丘振文， 廖小红

（1.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405；2.广州中医药大学附属中山医院，广东 中山 528400；3.广州中医药大学，广东 广州 510405）

疗筋涂膜剂由我院院内制剂改良研制开发，由大黄、两面针、黄芩、冰片、薄荷脑等中药组成，具有活血祛瘀、消肿止痛的功效。主要用于外伤性疾病和风湿性疾病［1-3］。常用有机溶剂为展开剂的薄层色谱法在疗筋涂膜剂黄芩的鉴别中出现斑点明显的拖尾和扩散，经过多次变换展开剂及比例、控制展开温湿度等均不能改善，引用微乳液为展开剂的薄层色谱，通过对比研究发现，可以明显改善常用展开剂鉴别黄芩时斑点拖尾严重、扩散的现象，分离效果及检测灵敏度显著提高，且斑点圆而集中，供试品清晰观察的斑点数由传统薄层色谱3个增加到9个，Rf值高的成分亦无扩散现象。微乳液是由表面活性剂、助表面活性剂、油和水按适当比例自发生成的无色透明、各向同性、低黏度的热力学稳定体系，与胶束体系皆属缔和胶体，但在基本特性上存在着明显的差别。微乳体系与胶束体系相比，具有更大的增溶量(增溶量:胶束体系5% ～20%，微乳体系60% ～70%)和超低界面张力(界面张力:油水界面72，胶束体系20，微乳体系10－2～10－4)［4-5］。微乳体系的以上优势有利于提高色谱的效率。参考文献［6-7］以含水量不同，具有油包水(W/O)型、双连续型(W/O～O/W)及水包油(O/W)型的6种SDS-正丁醇-正庚烷-水微乳液为展开剂，应用于疗筋涂膜剂中黄芩分离鉴定的研究发现，75%的微乳液为展开剂可以改善常用展开剂鉴别黄芩时斑点拖尾严重、扩散的现象，通过进一步优化文献微乳液的配比，分离效果及检测灵敏度更显著提高，此方法应用于苏木，两面针等成分也得到较理想的效果。

1 仪器与试药

1.1 仪器 CAMAG薄层色谱系统(UV-LAMPEN，TLC Plate HeaterⅢ，Holder for Digital Camera for Reprostar 3)，点样用定量毛细管(日本)；层析玻璃缸；超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；恒温干燥箱(北京市朝阳区来广营医疗器械厂)；DK-S24型电热恒温水浴锅(上海精宏试验设备有限公司)；电子分析天平(SARTORIUS AG GOTTINGEN Germany BP211D)。

1.2 试药 疗筋涂膜剂(制剂室自制，091223，091225，091227)；硅胶G(青岛海洋化工厂)；层析用聚酰胺薄膜(浙江省台州市路桥四青生化塑料厂)；黄芩苷对照品、黄芩、苏木、两面针对照药材(中国药品生物制品检定所)；十二烷基硫酸钠(SDS)(天津市大茂化学试剂厂)；正庚烷(天津市大茂化学试剂厂)；正丁醇(天津市富宇精细化工有限公司)；其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 微乳展开剂的配制2.1.1文献微乳展开剂的配制［6-8］在保证SDS-正丁醇-正庚烷为0.27∶0.63∶0.10(质量比)的条件下，改变水量，配制一系列微乳展开剂。按上述质量比取SDS、正丁醇、正庚烷，加适量水搅拌溶解，超声5 min，然后加水至足量，混匀，放置24 h即可。6种微乳液的成分配比及结构见表1。

表1 微乳展开剂成分配比及结构(总量100 g)

2.1.2 经过改良优化后微乳展开剂的配制［9］优化后SDS-正丁醇-正庚烷质量比为0.39∶0.52∶0.09，配制方法同

2.1.1 项下。6种微乳液的成分配比及结构见表2。选取文献配制一系列微乳展开剂，应用于疗筋涂膜剂中黄芩分离鉴定研究发现，W/O型微乳液(15% ～30%)为展开剂，色谱中斑点不规则，分离效果极差，展开速度较慢，两个溶剂前沿均不平整，基本不能分离，以油水双连续型微乳液(45% ～60%)为展开剂，分离度等有所改善，但也常常不理想，也达不到预期效果，以O/W型微乳液(70% ～80%)为展开剂，供试品中较多的组分达到分离，斑点规则集中，可以改善常用展开剂分离鉴定黄芩时斑点拖尾严重、扩散的现象，两个溶剂前沿也不平整，展开组分轨迹常跑偏，通过进一步优化文献微乳液的配比对比研究发现，以O/W型微乳液(70% ～75%)为展开剂，SDS-正丁醇-正庚烷质量比为0.39∶0.52∶0.09，分离效果及检测灵敏度更显著提高，两个溶剂前沿平整，组分轨迹平直。含水量75%微乳液为展开剂较70%含水量微乳液分离效果好，而且多分离出2个斑点，最终选择以改良后75%含水量O/W型微乳液为展开剂用于黄芩、苏木及两面针等成分，分离效果及检测灵敏度较高，得到较满意的效果。

表2 微乳展开剂成分配比及结构(总量100 g)

2.2 常用展开剂应用于黄芩的鉴别 取本品4 g，加乙醚30 mL，超声10 min，滤过，药渣挥干乙醚，加甲醇30 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水15 mL使溶解，用盐酸调节pH为1～2，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取黄芩苷对照品加甲醇制成每1 mL含1 mg的对照品溶液。再取缺黄芩的涂膜剂，同供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。照薄层色谱法(附录Ⅵ B)试验，吸取上述供试品溶液、阴性样品溶液各4 μL以及对照品溶液1 μL，分别点于羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板和聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)为展开剂，预饱和30 min，展开，取出，晾干，喷2%三氯化铁乙醇溶液，日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的暗绿色斑点，经过反复试验，改变供试品制备方法，变换展开剂及比例、控制展开温湿度等方法，黄芩苷斑点均拖尾和扩散。薄层色谱结果见图1。

图1 黄芩传统薄层色谱图

2.3 微乳液为展开剂应用于黄芩的分离鉴定 取黄芩对照药材1 g，照2.2项下制备黄芩的对照药材溶液，照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，取2.2项下供试品溶液、阴性样品溶液、对照品及对照药材溶液各1 μL，分别点于聚酰胺薄膜上，以75%的微乳液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视；黄芩苷为深蓝色斑点，斑点圆而不拖尾不扩散，供试品清晰观察的斑点数为6个，Rf值高的成分亦无扩散现象，阴性对照无干扰。喷2%三氯化铁乙醇溶液，日光下检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，均显相同颜色的斑点，斑点圆且集中，此时黄芩苷为深绿色斑点，供试品清晰观察的斑点数为9个，Rf值高的成分亦无扩散现象，3批供试品与黄芩对照药材溶液相同颜色位置有5个清晰的斑点。阴性样品无干扰，本方法专属性好，可以明显改善常用展开剂鉴别黄芩时斑点拖尾严重、扩散的现象，分离效果及检测灵敏度显著提高，且斑点圆而集中，清晰观察的斑点数较多，Rf值高的成分亦无扩散现象，说明微乳薄层色谱法可以简便、准确、高效地分离和鉴定疗筋涂膜剂中黄芩成分。薄层色谱结果见图2(a.365 nm荧光下，b.日光下)

图2 黄芩微乳薄层色谱图

2.4 微乳液为展开剂应用于苏木、两面针的同时分离鉴定 以上述微乳液为展开剂，将该法应用于疗筋涂膜剂中苏木、两面针同时分离鉴定。取供试品2 g，加乙醇10 mL，超声处理30 min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取苏木、两面针对照药材各0.5 g，同法制成对照药材溶液。取缺苏木、两面针的涂膜剂，同供试品溶液制备法制备阴性样品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述溶液各1 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以75%的微乳液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与苏木、两面针对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性样品无干扰，本法专属性好。供试品与苏木及两面针在色谱中清晰可见各2个荧光斑点，斑点圆，无扩散，分离效果及检测灵敏度较好。结果见图3。

3 讨论

本实验鉴于常用展开剂薄层色谱法应用于疗筋涂膜剂中黄芩等鉴别的斑点拖尾，扩散等现象，采用75%含水量O/W型微乳液为展开剂的微乳薄层色谱法分离鉴定，与传统薄层色谱法对比研究，可以明显改善常用展开剂鉴别黄芩时斑点拖尾严重、扩散的现象，分离效果及检测灵敏度显著提高，且斑点圆而集中，供试品清晰观察的斑点数增加到9个，Rf值高的成分亦无扩散现象。

图3 苏木、两面针微乳薄层色谱图

通过对文献微乳基本配比进行改良，选取改良后微乳基本配比的不同含水量微乳液与文献中配比为展开剂对比研究发现，W/O型微乳液(15% ～30%)为展开剂，色谱中斑点不规则，展开速度极慢，分离效果较差，以油水双连续型微乳液(45% ～60%)为展开剂，分离度等有所改善，但常不理想；以O/W型微乳液(70% ～75%)为展开剂，供试品中较多的组分达到完全分离，斑点规则集中，含水量75%微乳液为展开剂较70%含水量微乳液分离效果好，而且多分离出2个斑点，最终选择以改良后75%含水量O/W型微乳液为展开剂，微乳液 SDS-正丁醇-正庚烷质量比为 0.39 ∶0.52∶0.09，分离效果及检测灵敏度较高，得到较满意的效果。

微乳薄层色谱法展开剂使用不同含水量的微乳液，主要成分为水，且用量少，挥发性较小，彻底替代甲苯、苯等毒性大、致癌、污染大的有机溶剂作为展开剂；成本小、降低药材及成品检验的高成本；环保，对实验人员身体损害小；微乳液具有比胶束体系更大的增溶量和超低界面张力，更大提高色谱效率。微乳展开系统的增溶、降低界面张力、静电、疏水及立体效应，使其具有独特的选择性，可同时分离亲水物质和疏水物质，对带电成分和非带电成分亦有较好的分离选择，适用于分离差别很小的物质，色谱效率高。组分斑点不扩散，不受温度(室温)、湿度的显著影响、与常用展开剂相比，微乳液使斑点的荧光强度得到肯定的增强，因而检测的灵敏度得以显著提高，供试品制备可以只采用甲醇提取，节省有机溶剂，省去了常用展开剂薄层色谱法中的多极性溶剂提取分离、多次萃取等繁琐的“萃取、清洗”等步骤，极大地节省了实验的时间和提高了实验的重复性［10-11］。

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