HPLC法同时测定不同产地五味子中8种木脂素类成分

胡俊扬， 陆兔林， 毛春芹， 苏 桃， 蔡宝昌

（南京中医药大学药学院，南京中医药大学江苏省针灸学结合重点实验室，江苏 南京 210046）

五味子是木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实，是我国长期使用的补益类药物。其味酸、甘，性温。有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效。用于久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗、盗汗、津伤口渴、短气脉虚、内热消渴、心悸失眠等症［1］。五味子中含有多糖、挥发油和木脂素类成分［2-4］，其中木脂素类成分与其具有抗肝脏损伤、抗氧化的作用明显相关［5-7］。故木脂素的量直接影响五味子的质量及临床应用，由于基因遗传、生态环境、人工栽培、干燥程序、储存条件等因素的影响，不同产地五味子中木脂素的含有量有所不同。东北三省地区一直被视为五味子的道地产地，有无科学道理，迄今未见系统报道。2010年版《中国药典》以其中的五味子醇甲作为定量测定的指标，文献报道测定多集中在五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素中的3种或5种［8-11］。本实验建立了五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素8种木脂素的高效液相测定方法，并比较了不同产地五味子饮片中8种木脂素的含有量，为更好地控制五味子饮片及其制剂的内在质量提供了科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，配四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、UV检测器、ChemStation工作站控制系统，KQ-500E型医用超声清洗器(昆山超声仪器有限公司)，电子天平(Mettler Toledo AG285)。

1.2 试药 五味子醇甲(批号:110857-200709)、五味子醇乙(批号:110543-200708)、五味子酯甲(批号:111529-200503)、五味子甲素(批号:110764-200609)、五味子乙素(批号:110765-200710)，以上对照品均购自中国药品生物制品检定所，供定量测定用；五味子丙素(批号:DR20101018)，购自上海鼎瑞化工有限公司，纯度98%以上。戈米辛J(批号:10120821)和戈米辛G(批号:10120822)，购自上海同田生物科技有限公司，纯度98%以上。五味子饮片购自安徽铜陵饮片厂，经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定均为木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实。甲醇、乙腈为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为依利特ODS-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温30 ℃。流动相为乙腈(A)-水(B)梯度洗脱，0～17 min，A 为50%；17～25 min，A为50% ～55%；25～30 min，A为55% ～75%；30～35 min，A 为75%；35～40 min，A 为75% ～65%；40～45 min，A为65% ～50%。体积流量1.0 mL/min。检测波长217 nm，进样量为10 μL。色谱图见图1。

图1 对照品(A)与五味子饮片(B)HPLC色谱图Fig.1 HPLC Chromatograms of reference substances(A)and Schisandra chinensis(B)

2.2 对照品溶液的配制 分别精密称取五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、五味子酯甲、戈米辛G、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素对照品适量，用甲醇溶解，配制成单一对照品贮备液。另精密吸取各单一对照品贮备液适量，配制成含五味子醇甲0.2502 mg/mL、戈米辛 J 0.0520 mg/mL、五味子醇乙0.1099 mg/mL、戈米辛 G 0.0255 mg/mL、五味子酯甲0.0379 mg/mL、五味子甲素0.0516 mg/mL、五味子乙素 0.2070 mg/mL、五味子丙素0.0456 mg/mL的混合对照品贮备液，备用。

2.3 供试品溶液的制备 取不同五味子饮片，粉碎，过三号筛，精密称取约0.3 g，置25 mL量瓶中，加甲醇约20 mL，超声处理(功率250W，频率20 kHz)20 min，取出，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品贮备液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于 1 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度。精密吸取各质量浓度混合对照品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，测定。以峰面积对质量浓度进行线性回归。回归方程、线性范围及相关系数见表1。

表1 8种木脂素成分的线性关系、回归方程及相关系数Tab.1 Linear ranges and correlation of studied lignans

2.5 精密度试验 将五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素质量浓度分别为125.10、26.00、54.95、12.75、18.95、25.70、103.50 和 22.80μg/mL的混合对照品溶液，按2.1项连续进样5次，记录各自峰面积，并计算其RSD值。结果显示:五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的RSD值分别为:0.14%、0.39%、0.34%、0.38%、0.43%、0.16%、0.11%和0.30%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 精密称取2.3项下的五味子(辽宁)粉末约0.3 g，共5份，按2.3项下方法制备成供试品溶液，按上述色谱条件进行HPLC分析。根据所得8种木脂素的峰面积计算其在样品中的含有量。结果显示:五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的平均质量分数分别为8.0368、0.4607、1.5276、0.3412、0.4710、3.4370、3.7535和 0.4169 mg/g，RSD分别为 0.12%、0.76%、0.23%、0、92%、0.30%、0.10%、0.13% 和 0.73%，说明此方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取同一五味子样品供试品溶液，室温放置 0、4、8、12、24 h 后，按上述色谱条件进行HPLC分析，测定8种木脂素的峰面积。结果显示:五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素在不同时间峰面积的 RSD分别为0.28%、1.22%、0.90%、1.89%、1.17%、0.45%、0.38%和 1.22%。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验 分别精密称取8种对照品适量，置量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素质量浓度分别为 1.208、0.07、0.230、0.052 、0.07、0.52、0.56 和0.062 mg/mL的混合对照品溶液，备用。精密称取已知8种木脂素含有量的五味子样品约0.15 g，共9份。根据样品中五味子醇甲含有量的80%、100%与120%，分别加入混合对照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，各3份，按2.3项下方法制备成供试品溶液，按2.1项进行HPLC分析，根据测得量和加入量计算回收率。五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的加样回收率(RSD)分别为99.75%(0.38%)、100.69%(2.31%)、100.46%(1.39%)、99.87%(1.15%)、100.22%(1.45%)、100.15%(0.99%)、100.61% (0.25%) 和 101.31%(1.03%)。符合定量测定要求，表明本法准确可靠。

2.9 样品测定 取不同产地五味子饮片，粉碎，过三号筛，精密称取约0.3 g，各3份。按照2.3项下制备成供试品溶液，按2.1项进行HPLC分析，分别进样10 μL，记录峰面积，根据两点外标法计算样品中五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的量，结果见表2。

3 讨论

3.1 提取方法考察 根据文献［12-13］，本实验比较了甲醇、三氯甲烷和乙醇3种溶剂对五味子木脂素提取率的影响，结果显示其提取效果甲醇＞乙醇＞三氯甲烷，故以甲醇作为提取溶剂；同时考察了超声提取法和加热回流提取法，结果显示超声提取效率高于加热回流提取效率；并对提取时间进行了优选，以提取20 min最佳。所以本实验选择以甲醇为提取溶剂，以超声提取法提取20 min为提取方法对五味子木脂素类成分进行提取，且该方法为2010年版《中国药典》一部五味子项下的定量测定提取方法。

表2 不同样品中木脂素成分的测定(n=3)Tab.2 Contents of eight studied lignans in Schisandra chinensis(n=3)

3.2 色谱条件的选择 在实验中对多个色谱条件进行考察，包括色谱柱的选择、甲醇-水的不同配比与梯度洗脱和乙腈-水的不同配比与梯度洗脱、检测波长、柱温等条件，最终确定了本实验的色谱条件。

3.3 饮片的选择 在研究过程中，我们收集了东北三省、湖北、内蒙古、山西等产地，但是在该色谱条件下只有东北三省的五味子饮片能够全部测定其中7种，说明五味子具有道地性。2010年版《中国药典》只以五味子醇甲不得少于0.4%为测定标准，从表2中可以看出所测样品中五味子醇甲的质量分数均符合药典规定，并且黑龙江产地的8种木脂素成分总量最高，我们又收集了黑龙江不同产地的五味子饮片，发现并不是黑龙江所有产地的都高，其中以中和镇地区的五味子中8种木脂素成分的总量最高。但是所测样本中8种木脂素成分在总量上没有显著性的差异，只是在各成分含有量构成上有所不同。

4 小结

五味子为常用补益药，但是临床上用的饮片质量参差不齐，木脂素含有量高低不等，疗效很难保证。本实验建立的HPLC方法，样品中各被测组分的色谱峰基本达到基线分离，并且通过对方法学的考察，显示该分析方法具有准确、稳定、重复性好、灵敏度高等特点。并且从测定结果可以看出，五味子中虽然主要含有五味子醇甲，但是其他成分也并不低，比如在所测样品中五味子乙素的最低达到了0.37%，所以该研究结果表明单纯以五味子醇甲的含有量来评价五味子的质量是不够的，建议进行多指标的定量测定来控制五味子及其制剂的内在质量。本研究为中国药典进行多指标成分控制五味子饮片质量提供科学依据，同时为进一步研究五味子及其制剂的质量控制、药理活性以及临床使用提供了化学成分数据支持。

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