湿润烧伤膏对大鼠慢性难愈合创面组织中骨形成蛋白7表达的影响

兰海生 黄许森 单云龙 黄海舸 岑小宁 钟丽华 李明尚

【摘要】 目的 动态观察湿润烧伤膏对大鼠慢性难愈合创面组织中BMP-7表达的影响。方法 按照随机数表将54只健康成年SPF级SD雄性大鼠分为慢创组（18只）、美宝湿润烧伤膏（MEBO）组（18只）和贝复济组（18只），模型建立后，慢创组创面局部涂生理盐水、MEBO组局部涂美宝湿润烧伤膏、贝复济组局部涂外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子干预治疗，并分别于治疗后第3、7、14天检测并对比各组大鼠创面组织中BMP-7蛋白的表达水平以及脂肪细胞的生成情况。结果 （1）在治疗的第3天、第7天、第14天，创面组织中BMP-7蛋白的表达水平组内比较差异有统计学意义（P<0.05），BMP-7蛋白的表达水平逐渐升高（第3天<第7天<第14天），组间对比：MEBO组、贝复济组与慢创组比较差异有统计学意义（P<0.05），MEBO组与贝复济组比较差异无统计学意义（P>0.05）。（2）随着治疗时间延长，脂肪细胞生成数逐渐增多（P<0.01），其中MEBO组、贝复济组脂肪细胞生成数较慢创组多（P<0.05）。结论 湿润烧伤膏可有效上调创面组织中BMP-7的表达水平，促进创面组织中脂肪细胞的生成。

【关键词】 湿润烧伤膏;慢性难愈合创面;BMP-7;脂肪细胞

中图分类号：R642 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.09.003

体表慢性难愈合创面是指由多种原因引起的治疗1个月以上仍未愈合且无明显愈合倾向的创面[1]。慢性难愈合创面是外科常见疾病之一，因其治疗周期长、难度大及费用高，往往造成患者巨大负担。在创面修复过程中，往往伴随着一系列复杂炎症免疫反应及内环境变化，如：肌成纤维细胞在损伤部位迁移复位以及细胞外基质沉积，而过度的细胞外基质沉积往往造成疤痕愈合，疤痕愈合不仅影响美观同时也影响机体的功能，因此寻找有效促进慢性难愈合创面愈合，并且减少疤痕产生的药物成为临床研究的热点和难点[2]。目前研究表明，美宝湿润烧伤膏（MEBO）可通过调控血管内皮生长因子（VEGF）等多条信号通路促进创面愈合，但其对瘢痕修复的具体机制未完全阐明，而骨形成蛋白7（Bone morphogenetic protein 7，BMP-7）能够通过拮抗转化生长因子-β1（TGF-β1）等信号通路抑制纤维化，从而抑制疤痕产生[1，3～4]。遂笔者通过观察创面组织中BMP-7的表达情况，为揭示该药物在促进创面愈合，减少疤痕产生的部分分子机制提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

健康成年SPF级SD雄性大鼠54只购于长沙市天勤生物技术有限公司，鼠龄12～14周，体重240～270 g，于屏障环境动物实验室内进行饲养、造模、取标本。本研究经右江民族医学院实验动物伦理委员会批准。

1.1.2 主要试剂

贝复济（rb-bFGF，外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子，国药准字19991021，珠海亿胜生物制药有限公司生产）;湿润烧伤膏（moist exposed burn ointment，MEBO，国药准字Z20000004，汕头市美宝制药有限公司生产）;水合氯醛（CAS登记号302-17-0，泰兴市豪申化工贸易有限公司生产）;醋酸氢化可的松注射液（国药准字H31021290，上海通用药业股份有限公司生产）;改良油红O染色液（北京索莱宝科技有限公司，货号20190423）;BMP-7一抗：Rabbit Anti-BMP7抗体[EPR5897]，分子量：49 kD，abcam，货号ab129156，稀释比例：1∶1000;二抗：山羊抗兔的二抗，北京中杉，货号ZB2301，稀释比例：1∶3000。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及模型建立

按照随机数表将54只大鼠分为慢性难愈合创面组（慢创组）、MEBO湿润烧伤膏组（MEBO组）和贝复济组各18只，其中贝复济组为阳性对照组。以水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/l00 g）及背部备皮后，用直径为l.5 cm的图章标记，并在无菌条件下沿标记分别于脊柱两侧各做深达筋膜层的全层皮肤缺损创面，建立全层皮肤缺损创面后，立即肌肉注射醋酸氢化可的松注射液（8 mg/100 g），使其形成慢性难愈合创面，创面常规消毒后，慢创组创面局部涂生理盐水、MEBO组局部涂美宝湿润烧伤膏、贝复济组局部涂外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子，并予无菌干纱布包扎固定，每天换药2次[1，3]。

1.2.2 标本采集

分别于创面处理后第3天、第7天、第14天，从每组中随机选取6只大鼠，取创面组织制作冰冻切片，余暂时存放于液氮中，并置于-80℃的冰箱内储存备用。

1.2.3 Western blotting技术检测BMP-7蛋白表达水平

取组织100 mg，置于冰面上，加入1 mL组织裂解液，予匀浆机将标本搅碎，15 000 r/min进行离心20 min，取上清，提取组织蛋白，检测蛋白含量，并将蛋白变性后保存备用;将提取的蛋白上样置于80 V恒压下进行电泳，待条带均匀后，在300 mA恒流下进行半干转60 min，随即室温摇床封闭，并于4℃摇床内孵育一抗过夜;一抗孵育后，用PBST洗膜三次，每次5 min，并加二抗室温孵育l.5 h;二抗孵育后，用PBST洗膜三次，每次5 min，并于暗室內曝光;最后用Image J图像分析软件对检测结果进行灰度分析，样本蛋白含量=目的条带积分吸光度值/内参条带积分吸光度值[1，5]。

1.2.4 改良油红O染色检测脂肪细胞表达情况

取新鲜组织置于10%福尔马林固定10 min后水洗，于冰冻切片机制成10 μm厚度切片，切片入蒸馏水冲洗，再入60%异丙醇浸洗20 s，入改良油红O染色液中加盖密闭染色10 min，然后入60%异丙醇分色，入蒸馏水稍冲洗，Mayer苏木素染色液复染核2 min，入1%盐酸分化10 s，蒸馏水冲洗多余染料，滤纸吸干水分，甘油明胶封片，最后用Imagepro plus图像分析软件对脂肪细胞计数。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件对所得数据进行统计学分析，其中计量资料以均数±标准差（±s）表示，多個样本均数比较采用单因素方差分析，并根据方差齐性检验结果采用LSD法或Games-Howell法进行组间对比，组间不同时项对比采用重复测量方差分析，检验水准：α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 三组大鼠创面组织内BMP-7蛋白的表达水平对比

经重复测量方差分析，组间干预因素以及不同观察时项之间差异均有统计学意义（干预方法为主效应，F=26.52，P=0.01;以观察时项为主效应，F=71.01，P=0.001;两者交互作用，F=4.35，P=0.21），在治疗的第3天、第7天、第14天，创面组织中BMP-7蛋白的表达水平组内比较差异有统计学意义（P<0.05），BMP-7蛋白的表达水平逐渐升高（第3天<第7天<第14天），同一时项组间比较差异亦有统计学意义（P<0.05），其中MEBO组与贝复济组对比差异无统计学意义（P>0.05），BMP-7蛋白的表达水平，MEBO组=贝复济组>慢创组。见表1。Western blotting法检测BMP-7蛋白表达条带见图1。

2.2 三组大鼠创面组织油红O切片中脂肪细胞数对比

在治疗的第3天、第7天、第14天，创面组织油红O切片中脂肪细胞数组内比较差异有统计学意义（P<0.01），脂肪细胞数逐渐升高（第3天<第7天<第14天），同一时项组间比较差异亦有统计学意义（P<0.01），其中MEBO组与贝复济组脂肪细胞数第3天、第7天、第14天均明显多于慢创组，差异有统计学意义（P<0.01），第7天和第14天MEBO组脂肪细胞数多于贝复济组，差异有统计学意义（P<0.01）。见表2。大鼠创面组织的油红O染色情况见图2。

3 讨论

创面愈合包括了细胞的迁移、增殖分化、炎症反应、细胞生长因子分泌、基质沉积和血管形成等。在慢性难愈合创面愈合过程中，损伤炎症刺激后，成纤维细胞在趋化因子的作用下进入创口并分裂增殖，成纤维细胞的增殖和胶原的沉积有利于创面的愈合，但长期过度增殖和过多的胶原沉积往往导致增生性瘢痕形成，修复的瘢痕不仅影响美观，而且弹性较差、汗液蒸发缓慢、近关节处瘢痕易限制关节活动等一系列问题影响了组织的功能[6]。

因虚感邪，邪气致瘀，瘀阻伤正，化腐致损是慢性难愈合创面病情演变特点之一，随着对慢性难愈合创面了解的不断深入，近年来越来越多中医疗法应用于慢性难愈合创面的治疗，其中又以中医外治法效果最为显著[3，7]。MEBO由黄连、黄柏、黄芩、地龙、罂粟壳为主要成分，目前研究表明，MEBO所含的低分子蛋白质、脂肪和糖等营养物质，可直接作用于溃疡创面，并在局部被组织吸收，为创面组织的再生修复提供营养原料，加快创面的愈合，此外，MEBO干预治疗能通过调控ERK1/2和p38的传导信号通路明显提高创面肉芽组织VEGF、bFGF、EGF基因及蛋白表达，从而加速成纤维细胞、血管内皮细胞的增殖分化，调节创面修复基质的形成，促进肉芽组织生长及肉芽组织在创面的填充，促进创面成纤维细胞增殖和毛细血管再生，最终加快创面愈合的进程，减少创面疤痕的产生[1，8～9]。因其疗效显著，皮肤再生医疗技术（MEBT/MEBO）已纳入国家规划教材《中西医结合外科学》，同时制定相关临床应用规范，广泛应用于临床慢性难愈合创面的治疗[10]。

BMP-7是BMP家族中的成员之一，是一种分泌型多功能蛋白，BMP-7最初被认为具有促进骨形成的作用，但近年研究发现，BMP-7与多种疾病的抗纤维化作用有关。BMP-7因具有抑制纤维化、促进皮肤发育等功能，故BMP-7在创面修复中可能起到促进再生，减少疤痕愈合的作用。Smad依赖途径在调控纤维化中具有重要作用，BMP-7通常与受体结合并使之发生磷酸化后发挥作用。当受体磷酸化后，可作用于下游的Smad蛋白并与不同的Smad蛋白结合形成相应的转录调节复合物，从而进入到细胞核内作用于特定基因序列，发挥抗纤维效应[11]。Guo等人[12]研究证实，外源性给予BMP-7干预，可减少瘢痕组织中胶原沉积和纤维化蛋白的表达，且呈时间和剂量依赖型。在本研究中，创面形成的第3天，慢创组BMP-7蛋白的表达量低于MEBO组和贝复济组，随着时间延长，在创面形成的第7天和第14天，各组的BMP-7蛋白的表达逐渐上升，MEBO组和贝复济组表达量高于慢创组，提示美宝湿润烧伤膏和贝复济均能促进创面中BMP-7蛋白的表达。

在人皮肤中，BMP-7蛋白主要表达在表皮、真皮乳头层和毛囊外结构，其中在皮脂腺、汗腺、立毛肌和血管中显著表达，同时BMP-7蛋白的分布又随毛发周期改变而改变，提示BMP-7可能参与皮肤发育和功能的调节[13～14]。在创面愈合过程中，组织的再生需要新生毛囊，趋化因子通过激活骨形态发生蛋白信号的转导，促进成纤维细胞转化成脂肪细胞，从而促进毛囊的生成，促进再生。在本研究中，创面组织中的脂肪细胞随时间延长，数量增多，而在同一时项，MEBO组和贝复济的脂肪细胞生成数多于慢创组，提示美宝湿润烧伤膏能有效促进创面组织中脂肪细胞的生成，脂肪细胞充分填充皮下纤维结缔组织，有利于减少成纤维细胞的沉积，从而减轻创面疤痕修复。

综上所述，我们猜测，MEBO可能通过上调创面中BMP-7蛋白的表达，从而促进创面组织中脂肪细胞的生成，减少成纤维细胞的沉积，减少疤痕产生，促进创面的再生。但信号通路调控与创面修复的关系是相当复杂的，不同通路的激活与拮抗贯穿了修复与再生的整个过程，而瘢痕组织的过度增生也与免疫炎症反应有着密切的联系，本研究中只显示美宝湿润烧伤膏能够有效激活创面组织中BMP-7的表达以及脂肪细胞的生成，但其具体是如何调控下游信号通路仍需进一步研究。

参 考 文 献

[1] 葛斌，李利青，唐乾利，等.皮膚再生医疗技术对大鼠慢性难愈合创面组织中VEGFR-2表达的动态调控作用[J].中国烧伤创疡杂志，2017，29（6）：399-405.

[2] 曾鸿孟，唐乾利.体表慢性难愈合创面的研究进展[J].中国烧伤创疡杂志，2016，28（5）：340-344.

[3] 李利青，林也，葛斌，等.湿润暴露疗法/湿润烧伤膏干预PI3K-Akt-mTOR信号通路促进体表慢性难愈合创面修复的实验研究[J].中国中西医结合杂志，2019，39（5）：583-590.

[4] Meurer SK，Esser M，Tihaa L，et al.BMP-7/TGF-β1 signalling in myoblasts：Components involved in signalling and BMP-7-dependent blockage of TGF-β-mediated CTGF expression[J].European Journal of Cell Biology，2012，91（6-7）：450-463.

[5] 舒清峰，陈端凯，唐乾利，等.MEBT/MEBO对慢性难愈合创面组织中CK10表达水平的影响[J].中国烧伤创疡杂志，2019，31（2）：77-86.

[6] Limandjaja GC，van den Broek LJ，Waaijman T，et al.Reconstructed human keloid models show heterogeneity within keloid scars[J].Archives of Dermatological Research，2018，310（10）：815-826.

[7] 张云杰.中医药治疗慢性皮肤溃疡研究概况[J].山东中医杂志，2014，33（12）：1040-1042.

[8] 唐乾利.皮肤再生医疗技术的基础研究与临床应用进展[C]//中国中西医结合学会烧伤专业委员会，中国中西医结合学会.第15届全国烧伤创疡学术会议论文汇编：2018：9.

[9] 吴标良.基于MEBT/MEBO的ERK1/2和p38信号通路与糖尿病足免疫表达关系[C]//中国中西医结合学会烧伤专业委员会，中国中西医结合学会.第十四届全国烧伤创疡学术会议暨第二届国际烧伤创疡学术会议论文汇编：2016：4.

[10]何清湖.全国中医药行业高等教育“十三五”国家规划教材《中西医结合外科学》[M].3版.北京：中国中医药出版社，2016：309-310.

[11]Cervantes-Garcia D，Cuellar-Juarez A，Borrego-Soto G，et al.Adenoviral-bone morphogenetic protein-7 and/or doxazosin therapies promote the reversion of fibrosis/cirrhosis in a cirrhotic hamster model[J].Molecular Medicine Reports，2017，16（6）：9431-9440.

[12]Guo J，Lin Q，Shao Y，et al.BMP 7 suppresses excessive scar formation by activating the BMP 7/Smad1/5/8 signaling pathway[J].Molecular Medicine Reports，2017，16（2）：1957-1963.

[13]Adly MA，Assaf HA，Hussein MR.Expression of bone morphogenetic protein-7 in human scalp skin and hair follicles[J].British Journal of Dermatology，2010，154（3）：551-554.

[14]Plikus MV，Guerrero-Juarez CF，Ito M，et al.Regeneration of fat cells from myofibroblasts during wound healing[J].Science，2017，355（6326）：748-752.

（收稿日期：2019-07-11 修回日期：2019-09-10）

（编辑：潘明志）