缺氧诱导因子和Notch信号通路在上皮间质转化(EMT)疾病间的作用机制

王 萍，李铁刚

0 引言

上皮间质转化(EMT)是一种生物过程，其中上皮细胞失去顶端-基底极性的特征和标记，同时获得高迁移和侵袭能力的间充质细胞的特征[1]。近年来，EMT的研究热点是组织器官发生实质性癌变起始过程。缺氧是许多实体癌组织细胞微环境的主要改变，在缺氧条件下，缺氧诱导因子(HIF)通过结合缺氧反应元件激活下游众多靶基因，从而参与肿瘤能量代谢、血管生成、多药耐药以及侵袭转移等多个环节，通过Notch信号转导通路调节EMT，从而控制肿瘤侵袭和纤维化疾病等关键环节[2]。

1 缺氧诱导因子

HIF是依赖于氧气的关键介质。缺氧通过氧化还原作用和通过HIF的稳定化影响细胞生长的许多方面。异二聚体HIF转录因子家族由氧不稳定的α组成[3]，亚基(HIF1-3α)和氧稳定β亚基[HIF1-3β，或芳烃受体核转位蛋白1-3(ARNT1-3)]均含有碱性螺旋环(bHLH)和PER-ARNT-SIM(PAS)。

在细胞缺氧反应中,HIFα和HIF1β亚基不断转录和翻译，其在蛋白质稳定性方面有重要作用。由于在氧依赖性降解(ODD)结构域上的特定脯氨酸残基羟基化，HIFα在常氧期间迅速被降解，通过氧敏感的脯氨酰羟化酶结构域(PHD)蛋白[4]，羟基化的脯氨酸被泛素连接酶(VHL)识别，导致泛素化和随后的α亚基蛋白酶体降解。然而，在缺氧期间，PHD蛋白被灭活，导致α亚基的稳定化和积累，备用的HIFα与细胞核中的HIFβ(ARNT)相互作用以调节基因转录[5]。

HIF-1α和HIF-2α在结构上相似，但在功能上有所不同。HIF-1α可调节不同的下游基因组，包括促红细胞生成素和糖酵解基因。HIF-2α诱导c-myc、TGF-α、赖氨酰氧化酶[6]、Oct4、Cyclin D1等[7]。

有研究发现了新的HIF-1激活调节的步骤，可以靶向开发针对HIF-1相关疾病(如癌症)的治疗策略[8]。最近的泛基因组研究已经确定了数百个HIF转录直接靶点，其产物在细胞过程中发挥作用，包括LncRNA[9-10]和micRNA[11]。HIF-1调节一组microRNA，而部分microRNA可以靶向调控HIF-1α。microRNA和HIF1之间的相互作用与肿瘤发生相关的许多重要事件(如血管生成，代谢，细胞凋亡，细胞周期调节，增殖，转移和对抗癌疗法的抗性)有关，这可能是未来生物研究的热点[12]。

Notch可通过募集HIF-1α 上调LOX，从而稳定Snail，促进EMT。在百草枯诱导的纤维化模型中，HIF-1α及其下游靶基因LOX表达显著增加。PQ处理后E-cadherin表达降低，α-SMA表达显著增加，证实HIF-1α、LOX和EMT与PQ诱导的PF相关。HIF-1α沉默下调LOX mRNA和蛋白的表达。HIF-1α沉默后，EMT标志物的表达也发生逆转，细胞形态的变化减轻，这表明HIF-1α沉默后PQ诱导的EMT的程度减轻。HIF-1α可通过LOX/β-连环蛋白途径调节PQ诱导的EMT[13-15]。

MiR210通过靶向调节RUNX3直接与HIF-1α和PHD2的C末端激活结构域相互作用，促进百草枯诱导的EMT[16]。

2 Notch信号通路

Notch信号传导是进化上保守的细胞-细胞通信信号传导途径，由一个单通道跨膜受体(Notch1-4)组成，它可以通过与膜栓系配体的相互作用激活，包括Delta样(Dll)1-4和Jagged(Jag)1-2，其包含跨膜受体Notch和2个跨膜配体[17]Delta和Jagged。当Notch与邻近细胞的Delta或Jagged结合时，Notch被切割以释放进入细胞核的Notch细胞内结构域(NICD)，激活Notch途径并调节其靶基因[3,18 ]。NICD易位至细胞核并与转录调节因子CSL和辅因子MAML形成三聚体复合物，以诱导Notch下游基因反应。Notch下游基因标签在不同细胞类型中是多样的，并且包含Hes和Hey转录抑制因子的其他效应子[19-20]，在特定细胞谱系的发展过程中经常反复发生作用。在没有NICD的情况下，CSL与各种转录抑制因子相互作用，然后响应于Notch活化而被MAML取代，CSL结合共抑制剂主要是组蛋白修饰酶的复合物，使染色质保持紧密的无活性状态;而MAML蛋白募集转录共激活因子，主要是p300/CBP，具有组蛋白乙酰化酶活性[12]。此外，越来越多的证据表明，启动子/增强子的NICD-CSL募集诱导动态组蛋白表观遗传修饰，反过来又有利于三联复合物NICD-CSL-MAML或阻遏蛋白结合的CSL的可及性[21-23]。

Notch介导的生物反应涉及多种机制，Notch信号传导控制器官发生的各个方面，包括神经发生、血管发生、肌生成和造血[20]。此外，Notch途径还涉及细胞增殖和细胞死亡的调节和上皮-间充质转换(EMT)[24]。

3 Notch与细胞缺氧反应之间的EMT作用

染色质免疫沉淀实验表明，HIF-1α与NICD搭载在Notch反应性Hey2启动子上[27-28]，包括干细胞的维持[25]。近年研究表明，细胞缺氧与Notch信号通路有关[18]，特别是在EMT相关疾病中。细胞通过细胞反应适应缺氧，其中HIF-1α逐渐稳定并直接激活下游基因的转录。该途径的某些方面需要与Notch信号传导整合，即HIF-1α可以与NICD相互作用以增强Notch下游反应。研究表明，抑制因子的HIF-1(FIH-1)不仅调节HIF活性，还调节 Notch信号输出调节缺氧反应。研究显示，FIH-1在2个残基(N1945和N2012)上羟基化NICD，这对于NICD (细胞内的反式激活因子)以及体内神经发生和肌细胞生成期间的功能是关键的。

GSC中HIF-1α和Notch靶基因fabp7 mRNA水平升高。而负责HIF-1α基因转录的STAT3通路、磷脂酰肌醇3-激酶Akt和ERK1/2均参与HIF-1α蛋白的翻译，在GSC中也被优先激活，为HIF-1α作为胶质母细胞瘤治疗靶点提供依据[29]。FIH-1负调节Notch活性并加速肌原性分化。该研究揭示了Notch受体活化形式翻译后修饰与Notch和缺氧信号传导途径之间错综复杂的交叉偶联[30]。此外，研究表明，HIF诱导的Notch信号通路在肿瘤细胞EMT中起着关键作用[31]。

Notch信号与miRNA之间的联系是一个新兴的研究领域。二者之间的联系可以分为2类：一类是Notch通路中组分的表达可调控miRNA，另一类是miRNA调控Notch的情况。

关于Notch通路中调控miRNA的基因的研究较多，如DLL4(Notch配体)可以激活血管内皮细胞表达miR-27b，首次揭示了miR-27b在血管发育中可阻止血管过度迁移的特定功能，并将此确定为由血管生成抑制剂和刺激物调节的血管生成平衡的关键调节剂。

关于miRNA调控Notch的情况，Biyashev等[32-34]研究结果显示，miR-30家族表达导致血管内皮细胞高迁移率受Notch信号通路配体DLL4调控。与HIF一致，除miRNA外，Notch还可控制长非编码RNA (Long non-coding RNA，lncRNA)。作为T细胞急性淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia)中体内、体外生长所必需的一组lncRNA，LUNAR1也是受Notch转录复合物的控制，并且维持IGF1信号传导的能力[35]。最近在大规模非编码RNA测序方面的研究进展结果显示，其中，IL-33-miR-34a-5p-Notch1识别通过成骨细胞HIF-1α途径抑制破骨细胞生成，揭示了HIF-1α途径在骨重塑影响方面的新的机制[36]。

转录组学分析最初揭示了缺氧后神经母细胞瘤细胞中Notch1以及Notch下游基因的上调[25]，随后，已显示缺氧诱导Notch途径中基因的表达，并且Notch阻断消除了许多肿瘤类型中缺氧诱导的分化抑制[3]。HIF增加了乳腺癌细胞中Notch靶基因如HES1和HEY1的表达，也增加了Notch受体和配体的表达，并通过影响EMT通路的表达来调节乳腺癌细胞的迁移[37]，其机制可能与缺氧使HIF-1α和HIF-2α在细胞中积累有关，而缺氧与Notch辅激活剂MAML1协同增强Notch活性。HIF-1α在缺氧条件下与HES1启动子结合。

shRNA下调HIF-1α可抑制缺氧条件下HES1和HEY1的表达。HIF增加了Snail的表达，降低了EMT的标志E-cadherin的表达。Notch通路抑制消除了缺氧介导Snail表达的增加，以及乳腺癌细胞迁移和侵袭的减少，可能在EMT和乳腺癌转移的发生中起重要作用[38]。缺氧导致Jagged2表达增加，乳腺癌细胞中EMT[39]，以及乳腺癌细胞和内皮细胞之间的交叉反应[39]。Xing等[40]研究表明，由缺氧诱导的Jagged2表达介导的Notch信号传导的激活，通过促进EMT使Akt活化和细胞侵袭导致细胞存活，可作为转移性乳腺癌的新型治疗靶点。在一项绒毛膜癌的相关研究中，HIF-1α明显上调，增强且诱导了NICD增加，增强EMT和侵袭能力，伴随着HIF-1β的升高。同时，在小鼠体外实验中得到，通过对比对照组，用DAPT(Notch1抑制剂)敲低Notch1表达有效地抑制了转移性肿瘤生长、代谢和侵袭。结果表明，HIF-1α的过表达通过调节依赖于Notch信号传导途径的EMT来促进绒毛膜癌细胞的侵袭性和转移[5]。

Notch1的异常表达在小细胞肺癌非常普遍[41]，在非小细胞肺癌中可以观察到Notch功能获得性突变[42]。缺氧引起的Notch1上调使肿瘤细胞具有显著的生存优势，并且与异种移植实验中转移增加有关[43]。缺氧的微环境促使肿瘤发生一系列的适应性变化，包括肿瘤侵袭转移能力增加、放化疗抵抗以及出现一些靶向药物的耐药情况等。逆转肿瘤组织内的缺氧状态是肿瘤治疗的一个有前景的研究方向[44]。

4 结论

Notch信号传导和细胞缺氧反应之间的交叉反映了细胞如何应对低氧水平非常重要。从治疗的角度来看，细胞缺氧反应和Notch信号传导都涉及一系列病理过程和治疗靶点，特别是EMT疾病。