鱼类抗菌肽研究进展（二）

刘洪岩，薛晖，张世勇，王江，赵沐子，陈校辉，边文冀

（江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017）

3 Hepcidin

Hepcidin是一种富含半胱氨酸的多肽，最先在人源的hepcidin中发现其具有抗菌活性。此后，hepcidin在许多其他的脊椎动物被陆续发现，包括爬行类，两栖类和鱼类。在鱼类中，hepcidin最先从杂交条纹鲈中发现，目前至少已经在37种鱼类中鉴定到了该抗菌肽[1]。Hepcidin一般是一个由4个二硫桥形成harpin-折叠，包含8个半胱氨酸，然而鱼hepcidin序列分析表明，鱼类hepcidin只含有4，6或7个半胱氨酸[2]。

鱼类hepcidin基因在进化过程中发生了重复和多样化的过程中，产生了多重基因拷贝的，最多能达到八个之多[2]。Hepcidin基因由3个外显子和内含子编码一个信号肽，一个端功能前区和成熟肽。Hepcidin RNA转录的肽段大小的范围可以从81到96个氨基酸，而成熟的hepcidin只有19～31个氨基酸，与分子量约2～3 kDa。hepcidin的等电点一般8以上，因此，hepcidin是阳离子抗菌肽。不过也有例外，如预测斜带石斑鱼的hepcidin等电点只有5.4[3]。

鱼有两种 hepcidin，hamp1和 hamp2。然而，hamp1在辐鳍鱼和非辐鳍鱼中都有发现，而hamp2只在辐鳍鱼中有发现。此外，系统发育研究显示hamp2存在正向选择（但hamp1和哺乳动物中同源的基因却不存在），这表明不同的环境中的适应性进化可能与宿主和病原体的相互作用有关。

与其他抗菌肽基因类似，鱼类hepcidin可以由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌诱导表达。此外，酿酒酵母、肿瘤细胞系如L-1210和SAF-1也可以诱导hepcidin的表达。鱼类hepcidin基因也可以由病毒或聚I∶C以及有丝分裂原诱导表达。此外，环境雌激素内分泌干扰物β-雌二醇下调大口黑鲈肝脏hepcidin 亚型基因的表达[1，2，4]。

人类的hepcidin是II型急性期相关蛋白，细菌感染后的表达时序证明，hepcidin的表达高峰在发生在细菌感染后3～6 h以及腐烂发生时[5]。虹鳟感染鲁尔耶尔森氏菌后，hepcidin伴随着感染急性期反应蛋白如IL-1β，血清淀粉样蛋白A和小脑肽的前体上调表达。因此hepcidin可以作为II型急性期蛋白，参与到鱼类广泛的先天免疫反应中。

鱼hepcidin抑菌普非常广，对于革兰氏阳性菌和阴性菌的抑制浓度都在微米范围内，而且对大量鱼类病原菌的活性很强，例如能够杀死带鞭毛的金黄色葡萄球菌和假单胞菌[5]。此外，hepcidin和moronecidin能够协同作用抑制S.iniae和小肠结肠炎耶尔森菌[6]。并且，hepcidin对多种病毒起作用，人类的Hepc25能够诱导STAT3活化，导致抗病毒通路开启，从而抑制HCV病毒在细胞中的复制[7]。很少有研究能够阐明hepcidin对细菌的作用机制。在对人类的Hepc25研究中发现，与大多数抗菌肽不同，hepcidin作用于细菌时，并没有发生膜通透性的改变，同时凝胶阻滞试验证明，人类的Hepc25可以与DNA高效结合[8]。鱼类hepcidin中也有类似的试验结果。光发射动力学试验表明重组hepcidin前体、合成hepcidin同样不会引起大肠杆菌膜通透性[5]。

鱼hepcidin也具有抑制癌细胞生存的能力。例如，罗非鱼hepcidin TH2-3，表现出浓度依赖方式抑制人纤维肉瘤细胞株HT1080a的增殖和迁移。此外，TH2-3能够引起HT1080细胞膜破坏，并且能够下调c-Jun基因表达导致细胞凋亡。TH1-5能够调节免疫相关基因的表达，并且能够在低剂量时抑制肿瘤细胞（HeLa、HT1080 和 HepG2）生长，改变膜的结构、诱导细胞凋亡。在培养的HepG2细胞中，加入25 μM合成的Om-hepcidin或者5 μM合成的Omhepcidin前体，会导致细胞存活率下降40%，与omhep1相比，pro-omhep1具有更好的抗HepG2细胞活性[9]。

鱼hepcidin能够调节不同的免疫相关基因的表达。TH1-5转基因的斑马鱼能够上调IL-10、IL-21、IL-22、溶菌酶的表达；TLR-1、TLR-3 上调斑马鱼TNF-α、NF-κB等基因的表达。然而，TH2-3则起到TH1-5的拮抗作用。对多宝鱼的研究已经表明，hepcidin能够增加炎性细胞因子NF-κB的活性[10]。TH2-3也能够在小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞中调节蛋白激酶C的表达，而且还能够诱导细胞在形态上产生类似于PMA诱导的变化[11]。此外，在病毒引起的胰腺坏死感染的中，TH1-5调节某些干扰素和膜联蛋白的表达。

尽管具有抗菌和免疫调节作用，hepcidin最关键作用是运铁素的调节因子。运铁素可以通过内吞作用降解，这样能够减少血液对铁元素的吸收。虽然在鱼类中这种作用还没有被证实，但是hepcidin具有调节铁元素的能力。它也可以作为其他的二价金属的受体，如果暴露在其他二价金属如铜和镉，hepcidin的表达水平会上调。

4 Cathelicidins

与其他抗菌肽不同，cathelicidins成熟肽之间的同源性并不高。它们有着保守的前体肽N端区域，叫作cathelin结构域，成熟的有活性的抗菌肽由前体肽经过蛋白酶解后释放[12]。在哺乳动物中，不仅在不同物种间，即使在同一物种中，成熟的cathelicidin序列也存在很大的变化。总的来说，所有的哺乳动物cathelicidin成熟肽是阳离子抗菌肽，具有双亲性特征，在体外具有广谱抗菌活性。可以通过主要氨基酸序列比对发现，在C-末端有区显著的序列相似性，具有很强的阳离子并且富含甘氨酸。

鱼类中第一个cathelicidins来自大西洋盲鳗抗菌肽的分离，从编码这些肽的cDNA序列分析，发现它们具有同源性，这与哺乳动物中cathelins是相同的。根据有无二硫键，鱼cathelicidin分为两种类型。研究鱼cathelician发现一个高度的同源区域，这个区域似乎比哺乳动物中cathelin结构域更保守，成熟肽序列具有明显的同源性（90%），而不同类别之间的同源性较小。此外，最近在鳕鱼中发现了第三类cathelicidins，它们之间具有很高的同源性，但是与其它两种类相比较缺乏同源性[13]。

由不同物种提纯的cathelicidin，其体外抗菌活性表现出显著的差异性。例如，鳕鱼的cathelicidin对革兰氏阴性菌具有较高活性但是对革兰氏阳性菌几乎不起作用，同时它还对白色念珠菌有很强的杀伤作用。与此相反，盲鳗cathelicidins对革兰氏阴性菌和阳性菌都有很强的作用，但对白色念珠菌的作用很弱[14]。虹鳟鱼cathelicidins对Y.ruckeri的作用很强，而大西洋鲑鱼cathelicidins对Y.ruckeri并没有作用[15]。成熟肽序列的差异直接导致了抗菌活性的差异，可能是由于进化过程中，对抗的病原不同而产生的进化分歧。

基于其抗菌活性，cathelicidin在体内的作用机理和表达模式基本上已经研究清楚。抗菌肽的表达一般都是应答病原刺激，如细菌和病原相关分子，而抗菌肽又能进一步调节机体免疫。重要的是，cathelicidin在早期胚胎中就发现有表达，这说明它参与机体最早期的免疫。在体外培养的鲑鱼胚胎中，细菌和细菌的DNA都足以诱导cathelicidin的表达，这表明像哺乳动物一样，鱼的cathelicidin在宿主防御细菌中发挥类似的作用，但是纯化的LPS并不能诱导所有鱼类的cathelicidin基因表达。进一步研究发现，这与基因变异有关。大鳞鲑鱼的胚胎细胞就可以被I∶C、LPS、细菌的鞭毛蛋白诱导表达，而在虹鳟巨细胞中cathelicidin可以被先天免疫反应的重要介质IL-6诱导表达。此外，细菌及其产物可以诱导鳟鱼细胞系cathelicidin基因的表达[16]。体内研究进一步支持了这一假说。当香鱼注射活菌后，会在鳃、肝、脾、肠等组织中，时间依赖性的表达cathelicidin[17]。此外，大西洋鲑鱼和虹鳟感染Y.ruckeri后诱导抗菌肽cathelicidin的表达。大西洋鲑鱼的鳃与杀鲑气单胞菌孵育3 h之后可以产生cathe licidin，但是与鳗弧菌孵育则不能诱导cathelicidin表达。这表明抗菌肽cathelicidin在宿主防御中发挥作用的机制是复杂的[13]。

哺乳动物抗菌肽已被证明具有多种活性，其免疫和非免疫活性远远超过他们的体外抗菌活性。然而cathelicidin在鱼类中的研究远远落后于这一水平。最近的一项研究表明，两种大西洋鲑鱼catheli cidins可以快速、短暂的诱导外周血白细胞表达IL-8[18]。这表明cathelicidin的免疫调节活性在哺乳动物和鱼类中是相似的，这可能是一种进化上保守先天免疫调节机制。

5 鱼类抗菌肽的应用价值

所有抗菌肽特点都在理论上支持其发展成为治疗药物，包括广谱抗菌活、生化稳定性以及不产生耐药性。鱼类抗菌肽的特征更是为其应用提供了无限可能。总体来说，鱼类抗菌肽和其他物种的抗菌肽对于人源的病原体作用范围几乎相同，但是，它们对鱼类病原体更加有效，因为它们很可能与病原体一起进化。

由于很多抗菌肽在高盐度环境中都是不稳定的，来自于海洋鱼类的抗菌肽就可以补充这一缺陷。例如pleurocidin可以在300 mM NaCl环境中保持类似于其他piscidian的活性[19]。基于这种特性，pleurocidin可以被用于高盐度的环境，如血清，眼膜高渗血症等。除了抗菌药物，一些鱼类抗菌肽还具有体外抑制多种癌细胞的作用。

Piscidian已经被开发成多种药物了。例如，口服或注射epinecidin-1能显著提高斑马鱼和石斑鱼感染弧菌后的生存[20]；转染epinecidin-1的斑马鱼和石斑鱼在弧菌和无乳链球菌感染时，肌肉显著减少创伤[21]。此外，用epinecidin-1治疗耐甲氧西林金葡菌（MRSA）感染的小鼠，能够通过降低细菌数目增加小鼠存活率，并且增加小鼠伤口的愈合和血管的生成[22]。epinecidin-1可以用于制造灭活病毒疫苗。注射epinecidin处理过的乙型脑炎老鼠病毒（JEV）后，感染病毒时小鼠的存活率可达到100%，其性能优于福尔马林灭活的乙脑病毒疫苗。这是因为epinecidin可以调节免疫相关基因，包括增加血清中抗JEV的抗体，从而抑制病毒在脑中的复制[18]。

鱼hepcidin用于药物处于试验阶段。其中罗非鱼hepcidin TH2-3孵育过的创伤弧菌，能够增强感染和再感染时小鼠的存活率。TH2-3的抑制创伤弧菌的效果比四环素更好，并且在血脑屏障和肝脏中，也有同样的结果。

鱼类抗菌肽作为药物使用，阻碍其进一步发展的因素包括血清不稳定性，多肽合成费用高，以及蛋白酶不稳定性。研究者也在探索解决这些问题的方法，包括找出更小的片段，如抗菌肽的活性部位，可能会表现出更好的活性，以及与常规的抗生素连用，通过协同作用降低传统抗生素的使用浓度，从而降低细菌抗药性的产生。

6 总结

鱼类抗菌肽在结构，基因组成和功能上都是非常多变的，也因此提供给我们一个丰富的抗菌肽库。它们可以为更好地设计新型的治疗剂提供重要信息，既可用于治疗微生物感染，也可用于治疗癌症和其他病原菌感染。鱼类抗菌肽的很多特点使其在水产养殖中有很大的潜在应用价值。特定的鱼抗菌肽对鱼类病原体有很强的活性，同时一些病原体在鱼体内诱导先天免疫反应时会产生抗菌肽，这种复杂的关系表明抗菌肽机体是与病原体抗争的产物，并且与病原体一同进化。综上所述，抗菌肽为鱼类的宿主防御提供了坚实的基础，并且这些肽及其衍生物具有作为药物开发的潜力。