牛传染性鼻气管炎病毒部分gB蛋白的原核表达及抗原性分析

何小丽 李凡飞 王文佳

摘要：为对牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）gB基因进行原核表达，并对表达产物进行抗原性分析，利用笔者所在实验室已构建好的gB-BL21重组阳性菌落，进行异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，并对培养及诱导表达条件（IPTG最佳浓度、作用时间）等影响表达的因素进行优化，然后将表达的gB重组蛋白进行亲和层析纯化。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果表明，gB蛋白在大肠杆菌中高效表达，表达蛋白的相对分子量约为32.4 ku，与预期的蛋白大小一致。经BCA（聚氰基丙烯酸正丁酯）蛋白含量测定试剂盒测定，gB重组蛋白浓度为 1.84 mg/mL。Western Blot结果显示，纯化后的gB重组蛋白能被标准IBR阳性血清识别，说明表达的目的蛋白具有良好的反应原性，可作为IBRV检测的特异性抗原。试验为建立牛传染性鼻气管炎诊断方法及研究gB蛋白的功能特性提供了材料和技术理论支持。

关键词：牛传染性鼻气管炎;gB蛋白;原核表达;纯化;抗原性分析

中图分类号：S852.4+3   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）17-0189-04

牛传染性鼻气管炎（infectious bovine rhinotracheitis，简称IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，简称IBRV）[又称为牛疱疹病毒1型（BHV-1）]感染所引起的高度接触性传染病。该病具有广泛的嗜组织性，在临床上表现为呼吸道型、生殖道感染型、脑膜脑炎型和流产型4种类型。该病呈世界性广泛分布，世界动物卫生组织将其列为二类动物传染病，每年都给全球的养牛业带来了不可估量的经济损失[1]。BHV-1基因组中已被编码为蛋白的共有73个开放阅读框[2]。BHV-1编码的结构蛋白有33种，其中13种蛋白与核衣壳有关，10种编码糖蛋白[3]。gB是在病毒吸附、进入细胞及胞间扩散和融合中起着重要作用的主要膜蛋白，也是主要的抗原蛋白，是BHV-1中最保守的蛋白[4]。

我国于1980年从国外进口的奶牛中检测到了引起该病的病毒，自此许多学者开始对该病的流行病学进行调查，结果表明我国国内大部分省份已存在较为广泛的牛传染性鼻气管炎病毒的感染且呈现逐年上升的现象。目前，并没有特效的药物治疗此病，我国主要采取以预防为主的措施防控此病。本试验通过对IBRV gB蛋白的誘导表达，旨在获得IBR高效表达蛋白，为IBR的检测方法提供原材料和技术支持。

1 材料与方法

1.1 血清与菌株

IBR标准阳性血清，购自美国IDEEX公司;牛传染性鼻气管炎gB-BL21阳性重组菌株，由笔者所在实验室前期构建保存。

1.2 主要试剂盒

His标签蛋白纯化试剂盒，购自北京康为世纪生物科技有限公司;AEC底物显色试剂盒，购自索莱宝公司;AEC蛋白纯化试剂盒，购自凯基生物公司。

1.3 主要试剂

主要试剂如下：琼脂糖，购自西班牙;异丙基硫代-α-D半乳糖苷（IPTG），Thermo Fisher;氨苄青霉素（AMP），Amresco;琼脂粉，OXOID;蛋白彩虹marker，Thermo Fisher;十二烷基硫酸钠（SDS）上样缓冲液（2×），SDS购自西安国安生物科技有限公司;考马斯亮蓝G-250，Thermo Fisher;过硫酸铵，Biotopped;10%SDS;四甲基乙二胺（TEMED），Biotopped;1 mol/L pH值为6.8的Tris-HCl，Tris购自Biotopped;1.5 mol/L pH值为8.8的Tris-HCl;29 ∶ 1的丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺蛋白电泳缓冲液（5×），Biotopped;聚偏氟乙烯（PVDF）膜，Thermo Fisher;滤纸， 沈阳市长城过滤纸板有限公司;甘氨酸，西安国安生物科技有限公司;脱脂奶粉，完达山乳业;Tween20，Biotopped;磷酸缓冲盐溶液（PBS）;无水乙醇，天津市福晨化学试剂厂;0.22 μm滤膜，Sigma;Rabbit Anti-Bov IgG/HRP[辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG]，Sigma。其他化学试剂均购自天津市化学大茂化学试剂厂。此外，聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）蛋白纯化试剂盒，购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 重组蛋白gB的诱导表达及条件优化 取1 μL连接好的重组质粒PET32a-gB，涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，于37 ℃培养12～15 h。然后用无菌接种棒挑取单个重组菌落，接种于5 mL液体培养基中，37 ℃ 摇床上于 220 r/min 培养12～15 h。取培养的菌液按1 ∶ 50的比例接种于新鲜的LB（AMP+）液体培养基中，继续培养 2～3 h，直至D600 nm达到0.6～0.8，取1.0 mL菌液保存，作为IPTG诱导前样品，将剩余的菌液分成6管，分别向其中加入不同浓度的IPTG，使其终浓度依次为0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0 mmol/L，然后置于37 ℃摇床上培养，分别于1、2、3、4、5 h后从5管中各取1 mL诱导菌液，室温下于8 000 r/min离心 2 min，去上清，采用PBS重悬沉淀，重复离心，最后弃尽上清，用PBS重悬沉淀，混匀，然后向其中加入2×SDS上样缓冲液，置于沸水中煮沸5 min，取出后迅速放入冰浴中，适当时间后，放入-20 ℃冰箱中保存备用。

1.4.2 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的检测 按照说明配制分离胶与浓缩胶，在分离胶上面插入梳子，静置约30 min，使凝胶完全聚合。然后将玻璃制胶板放入电泳槽中，在电泳槽中加入适量的电泳液，缓慢垂直拔出梳子，用移液器冲洗加样孔。向第1个加样孔中加入蛋白彩虹marker，在相邻的泳道中依次加入样品。接通电源，起始电压为80 V，当染料进入分离胶后，提高电压至120 V，电泳1 h。待溴酚蓝到达电泳槽的底部时，关闭电源，小心地从玻璃板上剥下凝胶，切掉浓缩胶，并对分离胶进行标记，然后将其放入考马斯亮蓝染色液中，染色1 h。结束后，取出分离胶，将其转入脱色液中脱色，观察结果。

1.4.3 重组蛋白的可溶性分析 参照“1.4.1”节的方法，分别利用蛋白的最优表达条件对重组蛋白进行诱导表达，离心，弃上清，在沉淀中加入PBS重悬菌体，混匀。然后超声裂解菌体细胞，待菌液变清后，10 000 r/min离心10 min，收集上清，并向沉淀物中加入8 mol/L尿素，充分裂解。然后分别向收集好的上清和沉淀中加入蛋白上样缓冲液，煮沸5 min，快速放入冰浴中，适当时间后，进行SDS-PAGE分析。

1.4.4 重组蛋白的纯化分析 参照“1.4.1”节的方法，分别利用蛋白的最优表达条件对重组蛋白表达至最优的时间，取50 mL离心管，称量空管的质量并作记录，倒入诱导的菌液，离心，弃上清，加入去离子水重悬沉淀，再次以同样的条件离心，倒掉上清，称量离心管质量，得到菌体湿质量，每100 mg菌体（湿质量）中加入2 mL细菌裂解液（每毫升细菌裂解液中预先加入10 μL蛋白酶抑制剂混合物），超声破碎20 min，10 000 g低温离心15 min，收集沉淀，将沉淀重悬于Binding Buffer中，尽量混匀使包涵体充分溶解。20 ℃静置过夜，次日取出后，使用His（组氨酸）标签蛋白纯化试剂盒进行相关步骤纯化，然后对纯化蛋白进行 SDS-PAGE分析。

1.4.5 纯化蛋白浓度的测定 使用BCA蛋白纯化试剂盒对重组蛋白含量进行测定，具体步骤如下：

（1）按照表1依次向96孔板中加入相应试剂;

（2）将试剂盒中的A试剂与B试剂按照1 ∶ 50的比例配制BCA工作液，充分混匀;

（3）依次加入200 μL BCA工作液;

（4）将96孔板放在振荡器上振荡数秒，37 ℃孵育 30 min;

（5）在酶标仪上读取D562 nm，以蛋白含量（μL）为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线图;

（6）选取合适的浓度稀释gB蛋白，使其总体积为20 μL，加入BCA工作液200 μL，混匀，37 ℃放置30 min，以标准曲线0号管作参比，记录562 nm下的吸光度;

（7）根据所得样品的吸光度，在标准曲线上找出对应的蛋白含量，换算到原体积中，记录蛋白的浓度。

1.4.6 纯化蛋白的Western Blot分析 按照上述方法进行SDS-PAGE，电泳结束后，取出凝胶切下分离胶，标记方向，按照标准步骤进行蛋白质分子的转印，150 mA恒流，4 ℃ 3 h，将凝胶上的蛋白质转印到PVDF膜上。接著取出转有蛋白质分子的PVDF膜，采用5%脱脂乳封闭2 h，一抗（IBR标准阳性血清）4 ℃杂交过夜，次日取出后使用PBST（加了吐温的磷酸盐缓冲液）洗涤5次，加入二抗（Rabbit Anti-Bov IgG/HRP）杂交1 h，去除非特异性结合，再次洗涤，条件同上。洗涤结束后，使用AEC（3-氨基-9-乙基咔唑）底物显色试剂盒显色 15 min，之后用蒸馏水终止反应，观察并记录结果。

2 结果与分析

2.1 重组蛋白gB的诱导表达及条件优化

将连接好的重组菌落接种于培养基上，利用IPTG初步探索诱导表达，经过SDS-PAGE分析，结果表明，未经IPTG诱导的重组菌并没有出现特异性的条带，而经IPTG于37 ℃ 诱导后的重组菌落出现了特异性的条带，经分析其大小为32.4 ku，与预期的蛋白分子质量大小相符。为提高重组蛋白的表达效率，为以后大量制备蛋白奠定基础，分别以不同时间和不同IPTG浓度进行诱导条件的优化。最后通过SDS-PAGE蛋白凝胶电泳检测，由图1、图2显示，蛋白的表达量在37 ℃ 0.5 mmol/L IPTG诱导4 h时达到最大值。

2.2 重组蛋白的可溶性分析

分别将重组菌落经过最优的表达条件表达，离心收集沉淀后超声破碎，再次离心后对沉淀加尿素溶解，经SDS-PAGE分析，由图3可见，表达gB蛋白以包涵体的形式存在。

2.3 重组蛋白的纯化分析

由图4可知，根据gB蛋白的表达特性和最佳诱导条件进行表达纯化，得到1条约为32.4 ku的纯度较高的条带。

2.4 纯化蛋白浓度的测定

以BSA标准蛋白浓度为横坐标、吸光度D562 nm为纵坐标，制作标准曲线，见图5。根据BSA浓度与D562 nm的线性关系，得到了拟合曲线方程：y=0.078 6x+0.065 6，r2=0.998 9。经测定，gB重组蛋白的浓度为1.84 mg/mL。

2.5 重组蛋白的Western Blot检测

纯化的gB蛋白经蛋白转印、一抗二抗杂交，再经AEC显色之后，出现了1条纯度较高的目的条带（图6），提示表达的重组蛋白具有良好的反应原性。

3 结论与讨论

IBR近年来已经成为影响牧业发展的主要病原，对于我国而言它属于外来病原，首次发现该病在1980年，2005年我国在澳大利亚进口种牛中成功分离到该病毒[5]。2006年检测了来自内蒙古等11个省份的疑似感染IBR血清样本，结果显示抗体阳性率为46.0%[6]。2015年北疆4个规模化奶牛场IBR感染性抗体的平均阳性率为87.4%[7]。2016年笔者所在团队对宁夏地区进行IBR的抗体检测，平均阳性率高达85.1%[8]。我国作为奶牛养殖业大国，但由于我国整体的养牛水平不太高，每年都要从一些养牛水平高的国家进口大批的牛，2015年Moore等的研究表明，澳大利亚出口的活牛IBR血清阳性率为39.0%[9]，这些数据均表明IBR感染的普遍性和严重性，我们应提高警惕避免该病发生大面积暴发。

gB蛋白是IBRV主要的抗原蛋白，在机体的免疫保护中起着至关重要的作用[10]。目前，IBRV的诊断试剂大多数均针对gB抗原表位。本研究采用笔者所在实验室构建好的gB重组菌株，使用大肠杆菌的表达系统，大肠杆菌的表达系统以其高效表达的优点成为近些年来首选的表达系统[11]。相对于全基因表达，gB部分基因表达克服了蛋白表达量低、抗原性弱等缺点，目的蛋白在大肠杆菌表达系统中获得了大量高效的表达。在选择蛋白纯化方法时，采用镍柱亲和层析法，方法简便、利于操作及实验室蛋白的大量纯化，分离纯化效果好，纯化后的蛋白经免疫印迹检测，能与IBR标准阳性血清发生特异性反应，说明表达的gB蛋白具有良好的反应活性，可被用来作为IBRV检测的特异性抗原。

本研究成功獲得了IBRV gB蛋白，为应用建立IBR诊断方法和制备gB蛋白多抗和单抗，作为抗原免疫动物提供了重要的物质基础和技术支持。

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