甘草MYB转录因子GlMYB10的克隆与表达分析

王佳琦 王璐 潘玉光

摘要：根据甘草悬浮细胞经茉莉酸甲酯（MeJA）诱导前后的转录组测序结果，筛选到1个响应MeJA诱导的MYB转录因子基因，通过克隆该基因片段并进行序列分析确定该基因编码1个甘草MYB转录因子，将其命名为GlMYB10。该基因开放阅读框全长为1 172 bp，编码产物包含340个氨基酸，对其编码产物的基本理化性质、亲水性和疏水性、保守结构域等方面进行了生物信息学分析和预测，对GlMYB10基因编码产物的氨基酸序列进行聚类分析。结果表明，其与木豆中MYB类转录因子的同源性最高。应用qRT-PCR分析该基因的表达水平发现，GlMYB10基因在甘草悬浮细胞受MJ诱导后的表达量明顯高于未诱导组，并且诱导9 h后表达量最高。通过对GlMYB10基因进行克隆与表达分析，为探索该基因在甘草悬浮细胞黄酮类化合物生物合成中的调控作用奠定基础。

关键词：甘草;悬浮细胞;茉莉酸甲酯;MYB转录因子;基因克隆;基因表达

中图分类号： S567.7+10.1  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）17-0067-04

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch），豆科多年生草本植物，主要分布在内蒙古、宁夏、新疆、甘肃等西部地区，具有抗炎、抗病毒、抗癌防癌、保肝解毒、调节免疫功能以及降血脂、抗动脉粥样硬化等心脑血管药理活性，是应用最广的补益类药食兼用的大宗药材[1]。近年来，由于无节制采挖、过度放牧及不合理工农业占地等，野生甘草资源逐年锐减，栽培品种收获期过长使得靠大面积人工栽培来满足市场需求存在诸多困难。植物细胞大规模培养技术是目前公认的最有前景的珍贵植物药物资源的替代生产技术之一，可以很好地解决天然植物资源匮乏问题。但由于植物细胞遗传与生理的不稳定性及细胞间的不一致性等各种原因，使得甘草悬浮细胞中主要目标产物——黄酮类化合物的含量很低，阻碍了通过细胞培养工业化生产药用成分的进程。

转录因子作为转录起始过程中RNA聚合酶所需的辅助因子，可激活特定次生代谢产物系列合成酶的协同表达，有效地促进目标次生代谢产物的合成。因而利用转录因子构建高产的转基因细胞系成为提高产量的有效途径之一。MYB类转录因子是植物中数量最多、功能最多样化的一类转录因子[2]，许多研究表明MYB转录因子家族在植物黄酮类化合物合成代谢调控中发挥更主要的作用[3]。Moyano等发现MYB340和MYB305在金鱼草花中特异表达，MYB305激活了苯丙烷代谢途径的第1个酶苯丙氨酸酶（PAL），MYB340激活了Pal基因启动子的转录，这2种转录因子还能激活黄酮代谢途径中其他两个基因的表达，因而将植物次生代谢的早期和晚期步骤连接起来[3]。原花青素（proanthocyanidin）[3]、黄酮醇（flavonol）[4-6]、异黄酮（isoflavonoid）[7]等类黄酮的合成均受到MYB类转录因子的调控。

茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）是植物次生代谢途径中最主要的信号分子，它常常作为第二信使参与植物次生代谢物尤其是黄酮类化合物的合成调控[8]。为进一步探明MYB转录因子在甘草黄酮类化合物合成中的作用，本研究利用甘草悬浮细胞受MeJA诱导后的转录组测序数据进行分析，得到1条响应MeJA胁迫的MYB转录因子基因GlMYB10，通过RT-PCR的方法克隆得到该基因，再通过生物信息学软件分析该基因的特征，同时利用荧光定量PCR比较甘草细胞悬浮体系中添加MeJA后各时间段GlMYB10基因的表达水平，为深入研究MYB转录因子基因在甘草黄酮类化合物生物合成途径上的分子调控机制提供依据，对进一步构建转基因高产细胞株具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验于2017年10月在内蒙古科技大学植物细胞培养实验室进行。供试的甘草品种为乌拉尔甘草，种子购自内蒙古鄂尔多斯市达拉特旗。愈伤组织由幼嫩的甘草无菌苗下胚轴和子叶诱导而来，在附加0.5 mg/L 2，4-D、0.5 mg/L NAA与0.5 mg/L 6-BA的固体MS培养基上培养和继代。悬浮培养系统：取6 g分散性强、生长状态良好的固体细胞置于250 mL三角瓶中，120 r/min振荡培养，悬浮培养基为100 mL液体MS培养基+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA，光照度36 μmol/（m2·s），光照时间16 h/d，培养温度25 ℃[7]。

反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，质粒DNA小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、pUCm-T载体均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。T4-DNA连接酶、限制性内切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ均购自宝生物工程（大连）有限公司。大肠杆菌（Escherichia coli）Top 10购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 甘草悬浮细胞总RNA的提取及cDNA的合成 将悬浮培养的甘草细胞抽滤后迅速转移至研钵中研磨，同时向研钵不间断地添加液氮，研磨成细细的粉末即可。总RNA提取步骤严格按照TaKaRa Total RNA提取试剂说明书进行操作。以提取的甘草悬浮细胞总RNA为模板，利用Prime ScriptTM Reverse Transcriptase Kit合成cDNA第1链。

1.2.2 引物设计 根据对转录组测序结果中目标基因的ORF序列使用Primer 5.0设计特异引物：GlMYB10-F，5′-ACCTCCTCCACTACTCTTCATTA-3′;GlMYB10-R，5′-TCATAAAGATCCAAATTGGCA-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 GlMYB10基因的克隆 以cDNA作为模板，利用合成引物进行快速体外扩增。产物用生工生物工程（上海）股份有限公司SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行纯化。纯化后的PCR产物与pUCm-T载体在T4-DNA连接酶作用下于16 ℃过夜酶连，之后转化到Top 10大肠杆菌中，37 ℃培养箱过夜培养。长出单菌落后，画线培养，菌落PCR验证。EcoRⅠ、Hind Ⅲ双酶切过夜电泳再次验证目的基因与pUCm-T克隆载体已导入大肠杆菌Top 10。菌液送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序分析。

1.2.4 序列分析 使用序列分析软件DNAMAN将测序结果进行拼接，找出GlMYB10开放阅读框（ORF），并翻译获得其编码的氨基酸序列;在GenBank中下载其他植物的MYB转录因子氨基酸序列与GlMYB10进行Blast同源性对比，得出不同植物MYB转录因子氨基酸序列;利用MEGA 7.0软件构建系统发育进化树。把甘草GlMYB10蛋白进行分析（http：//web.expasy.org/protparam/），推测蛋白的分子量。利用ProtScale工具（http：//web.expasy.org/protscale/）对甘草GlMYB10蛋白进行亲水性/疏水性分析。通過PORTER（http：//distill.ucd.ie/porter/）进行分析，对该蛋白中各个氨基酸残基对应的二级结构进行预测。将GlMYB10基因编码的氨基酸序列提交至SWISS-MODEL在线分析软件，预测蛋白质的三级结构。

1.2.5 甘草细胞GlMYB10基因在不同MeJA诱导处理时间的表达分析 以甘草悬浮细胞系为研究对象，将生长状态良好的种子细胞接种于新鲜培养基培养48 h后，添加 100 mol/mL MeJA进行诱导，以加入无水乙醇（配制MeJA的溶剂）为对照组，分别在添加后1、3、6、9、12 h取样，提取总RNA，并反转录成cDNA，方法同“1.2.1”节，对GlMYB10基因进行荧光定量PCR，以Actin作为内参基因，参照2×SYBR Prime ScriptTM RT-PCR Kit（TaKaPa）荧光定量试剂盒说明书进行荧光定量试验，采用2-ΔΔCT法对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 甘草悬浮细胞总RNA的提取

紫外分光光度计测得总RNA的D280 nm/D260 nm、D260 nm/D230 nm均在2.0左右，纯度较好，所提RNA浓度均在1 500 ng/μL左右，可用作下一步试验，琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

2.2 甘草MYB转录因子GlMYB10基因的克隆

反转录试剂盒一步法将甘草无菌苗总RNA反转录成cDNA，测其浓度均在1 800 ng/μL左右，利用设计合成的引物对其进行20 μL体系快速扩增（图2）。对PCR产物中 1 000 bp 左右处的条带进行回收后与pUCm-T载体连接，转化到大肠杆菌Top 10，37 ℃过夜倒置培养至出现单菌落，划线再培养过夜至长出菌落，依次挑取菌落1/3左右按 10 μL 体系进行菌落PCR验证，1%琼脂糖凝胶电泳检测。由图3可见，大肠杆菌Top 10菌落中的目的基因已被插入，挑取该菌落摇菌提质粒，用EcoRⅠ、Hind Ⅲ双酶过夜跑电泳再次验证，送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

2.3 甘草GlMYB10基因的生物信息学分析

克隆到的GlMYB10转录因子cDNA序列包含1个 1 172 bp 的ORF，共编码340个氨基酸;用Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）对GlMYB10蛋白在线分析，推测其分子量为38.718 14 ku，等电点为8.51。选取甘草GlMYB10蛋白与其他植物中功能已确定的转录因子蛋白序列，经MEGA 7.0软件邻接（neighbour joining，NJ）法构建系统发育树结果见图4。根据图4中所示分枝的长度，计算出乌拉尔甘草与其他物种亲缘关系，其由近及远依次为赤豆、甜橙、大豆、木豆、紫苜蓿、狭叶羽扇豆、蓖麻、鹰嘴豆、四季豆。其中，与豆科植物赤豆亲缘关系较近，相比之下，与豆科亲缘关系较远。

利用ProtScale工具（http：//web.expasy.org/protscale/）对GlMYB10转录因子蛋白进行亲水性/疏水性分析，发现其亲水区域大于疏水区域，所以该蛋白属于亲水蛋白。通过SOPMA对GlMYB10转录因子蛋白的二级结构预测，结果显示，该蛋白中α-螺旋为27.73%、β-折叠为0、β-转角为944%、无规卷曲为40.71%、延伸链为22.12%，α-螺旋和无规卷曲为为主要的结构元件，而β-转角和延伸链则散布于蛋白中。通过SWISS-MODEL对GlMYB10基因所编码的氨基酸序列在线分析，预测蛋白质的三级结构，从图5看出，该蛋白含有大量的α-螺旋与无规卷曲和β-转角，与二级结构预测结果相符。

2.4 荧光定量PCR表达分析

使用SYBR Green化学染料，运用的qRT-PCR方法对正常悬浮培养的细胞与添加MeJA诱导培养的细胞分别在添加后不同时间点进行取样和GlMYB10基因的表达分析，数据采用2-ΔΔCT法进行分析，即先根据“ΔCT=CT，目的基因-CT，内参基因”计算，再根据“ΔΔCT=ΔCT，试验组-ΔCT，对照组”进行计算，最后依据“相对表达=2-ΔΔCT”计算出相对表达数值。以处理时间为横坐标，相对表达量为纵坐标做图。

由图6可以看出，在1～12 h期间，GlMYB10基因在添加MeJA诱导后的几个时间点相对表达量都大于对照组，并且在 9 h 表达量最高，说明转录因子GlMYB10基因的表达明显响应信号分子MeJA的诱导。

3 讨论与结论

转录因子是生物体内的一种蛋白因子，它能与结构基因上游特异性DNA序列结合，并对基因的转录起调控作用[9-10]。研究表明，在许多功能基因的启动子中都含有MYB结合元件（核心序列为TAACTG），在逆境胁迫下，MYB转录因子与该元件的结合能够激活胁迫应答基因的表达。另外，MYB基因明显受环境因子所诱导，如信号分子脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）等[11-14]，Chen等对125个R2R3-MYB成员的研究结果表明，约32%成员受JA诱导，约4%下调[15]。这些初步的结果表明，MYB转录因子广泛地参与了对调控植物逆境胁迫响应有重要作用的激素应答过程。MeJA是茉莉属素馨花中香精油的有气味化合物，在植物中广泛分布，广泛参与了植物防御信号的转导与放大过程[12]，引起细胞抗逆反应产物的表达，对多种次生代谢产物的合成具有诱导作用，被认为是非常有效的诱导子。MeJA已在多种药用植物细胞培养中使用，效果显著[13-15]，如外源的MeJA对于重要的药用次生代谢产物如紫杉醇、长春碱、东蓑若碱、尼古丁、青蒿素等均有显著的诱导合成作用[16-17]。

本研究将添加MeJA诱导后表达差异显著的MYB转录因子GlMYB10基因克隆出来，该基因具有长度为1 172 bp的完整ORF，编码340个氨基酸，该蛋白相对分子量为 38.718 14 ku，理论等电点为8.51，亲水区域大于疏水区域，属于亲水蛋白。对该基因进行生物信息学分析，序列比对发现其属于典型的MYB基因家族。另外以甘草悬浮细胞为研究对象，在种子细胞接种于新鲜培养基48 h后加入信号分子MeJA诱导，用荧光定量PCR技术检测诱导不同时间后GlMYB10基因的表达情况，结果表明，添加MeJA诱导后明显提高了GlMYB10基因的表达，且在诱导后9 h表达量最高，MeJA诱导后不同时间段的差异性表达有利于进一步了解转录因子GlMYB10在甘草细胞悬浮培养过程中调控黄酮合成的作用。

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