丙泊酚抑制过氧化氢诱导细粒棘球蚴原头节凋亡作用机制的初步研究

马斌 ，汤光耀 ，王麟尧 ，姜玉峰 ，吕海龙

1.石河子大学医学院第一附属医院肝胆外科，新疆石河子，832008；2.石河子大学医学院基础医学系，新疆石河子，832002

囊性包虫病是由细粒棘球蚴原头节的幼虫阶段引起的人畜共患病，成全球性分布。该病是一种人畜共患疾病，严重危害人类健康，一旦发病治疗比较复杂，病情严重者愈后较差[1-2]。人类因口服寄生虫卵而感染。卵在胃肠道中孵化，穿透肠壁，进入血液，最终可定居在人体的多种器官，在侵犯脏器中生成囊泡产生占性效应，囊泡一旦破裂会产生并发症[3]。据临床调查报告，该病在肝脏组织中最为常见，约占75%，其次是肺，约占15%，脾，肾，骨，脑及其他器官中亦可见到[4-5]。这是一个全球公共卫生和经济问题，主要流行于世界范围内的畜牧地区。随着医疗环境及技术水平的发展,在此种术式的基础上，为提高手术的成功率及改善患者愈后，有多种手术方式相继推广，如肝包虫内囊摘除术+外囊部分摘除术、肝部分切除术及肝包虫囊肿超声引导穿刺。传统手术方式在肝包虫的治疗上有很重要的历史地位,是临床上最常用的方法。许多临床问题是传统手术无法避免的,如术后复发率高(4.5%～20.2%)[6-9]和并发症多(8.8%～65.8%)等[7,10-11]。

近年来越来越多的研究有关于包虫的药物治疗，但是效果不明显。该研究通过初步探讨丙泊酚抑制过氧化氢诱导细粒棘球蚴原头节凋亡的作用机制，了解细粒棘球蚴原头节可以增HO-1酶活性及降低ROS水平起到自我保护作用，希望为囊性棘球蚴病的治疗提供一个新的有针对性的治疗方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料

取含有包虫囊泡的羊肝，在实验室内使用注射器抽出原头节，备用。丙泊酚购于西安立邦有限公司；H2O2、HO-1及ROS试剂盒购于南京建成生物科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO)、RPMI 1 640培养基及小牛血清购于美国sigma公司。

1.2 体外培养细粒棘球蚴原头节

将自然感染细粒棘球蚴原头节的绵羊肝脏清水冲洗干净后用75%医用酒精消毒肝脏表面，无菌注射器反复抽吸囊泡内的囊液及原头节，集中在无菌瓶内弃去囊液保留原头节。超净台内将提取后的原头节使用PBS（已高压）洗掉原头节内的杂质，待离心管内的PBS清亮及原头节沉降速度接近同步且较快时（活性好的原头节比重高在水中沉降速率快），停止清洗。将原头节在PBS内混匀随机抽取约200～300个原头节进行伊红染色约5 min，在倒置显微镜现观察原头节活力（活力好的原头节拒染，死亡的及活力差的原头节红染）。反复使用PBS清洗，保证原头节活力在95%左右。然后将保留的原头节放入含有小牛血清及双抗的RPMI 1 640培养基中，放于37℃、5%CO2恒温培养箱内培养。

1.3 实验分组及观察原头节活力

实验分为DMSO空白对照组，丙泊酚（0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、0.75 mmol/L、1 mmol/L） 模型对照组，0.5 mmol/L H2O2组，丙泊酚（0.5 mmol/L、0.75 mmol/L、1 mmol/L）预处理8 h+0.5 mmol/L H2O2组。按实验分组在六孔板内加药后，放置于37℃、5%CO2培养箱内培养。倒置显微镜下观察各实验组原头节活力，实验重复3次。

1.4 Elisa检测HO-1酶活力

取0.5 mmol/L H2O2组及1 mmol/L丙泊酚预处理8 h+0.5 mmol/L H2O2组作用6 h后的原头节，PBS清洗3次。每 3 000个原头节中加入150 μL裂解液，超声破碎，在4℃、12 000转条件下高速离心10 min后，抽取上清液。按照HO-1检测试剂盒步骤将反应体系加入96孔板中，于37℃避光孵育，待颜色变化较明显时，用Bio-RAD酶标仪检测吸光度（A405值）。实验重复3次。

1.5 ROS水平的测定

取0.5 mmol/L H2O2组及1 mmol/L丙泊酚预处理8 h+0.5 mmol/LH2O2组作用6 h后的原头节，PBS清洗3次后，更换含DCFH-DA10 μmol/L无血清培养基，37℃避光孵育1 h，弃培养液，PBS清洗3次，静置，待自然沉淀后收集原头节，用Bio-RAD荧光酶标仪检测DCFH OD值，488 nm激发波长，525 nm发射波。然后用PBS清洗3次，并在荧光显微镜下观察原头节。实验重复3次。

1.6 统计方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，单因素方差分析 （ANOVA）和最小显著差法(LSD)检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同实验组药物作用后原头节活力的变化

不同浓度的丙泊酚作用于原头节24 h的活力曲线见图1a，各组原头节活力均大于95.0%。实验表明丙泊酚对原头节无毒性作用。丙泊酚抑制过氧化氢诱导原头节的凋亡见图1b用丙泊酚（0.5～1 mmol/L）处理原头节8 h后，在新鲜的培养基中再加入0.5 mmol/L H2O2共培养 6 h。0.5 mmol/L、0.75 mmol/L 和 1 mmol/L丙泊酚组对应原头节存活率分别为48.0%,58.0%和65.5%。单独使用0.5 mmol/L H2O2培养丙泊酚6 h原头节的活力为38.0%。结果表明丙泊酚抑制原头节在过氧化氢中的凋亡，且具有浓度依赖性。

2.2 过氧化氢及丙泊酚作用后原头节中HO-1酶的表达

0.5 mM H2O2处理细粒棘球蚴原头节6 h及1 mM丙泊酚预处理原头节8 h后加入0.5 mM H2O2培养细粒棘球蚴原头节6 h后分别进行HO-1酶检测结果如图2所示。单独使用H2O2原头节内HO-1酶活性较对照组稍增加，而使用丙泊酚预处理过的原头节体内HO-1活性表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 过氧化氢及丙泊酚作用后原头节中ROS水平的变化

DCFH-DA染色法荧光显微镜观察可发现0.5mmol/L H2O2及1 mmol/L丙泊酚组均可见绿色荧光，加入丙泊酚组荧光强度较0.5 mmol/L H2O2组明显降低。可知丙泊酚可以激活原头节内的抗氧化应激系统。差异有统计学意义（P＜0.05）。 见图 3。

3 讨论

临床中手术治疗作为首选。包虫病的现代手术治疗不仅创伤小且提高了治愈率并降低了并发症。但是对于一些复杂的病例也无能为力，如包虫侵犯第一肝门或者位置较深难以完全切除。归根结底产生并发症的主要原因是因手术切除不彻底，或有活性的原头节外溢引起的复发。因此，对于改善手术治疗不彻底、术中原头节外漏或者晚期包虫病患者的生活质量，药物治疗不可缺少。

Gu J等[12]发现丙泊酚诱导SH-SY5Y细胞中血红素加氧酶1(HO-1)表达升高抵抗H2O2的破坏作用。实验中使用不用浓度的丙泊酚培养SH-SY5Y细胞观察丙泊酚无毒性。单独使用1 mmol/L H2O2处理SHSY5Y细胞24 h，细胞生存率为48%。使用25 μM，50 μM，75 μM，100 μM 丙泊酚预处理 SH-SY5Y 细胞8 h后加入1 mmol/L H2O2共培养24 h细胞的生存率分别为60.94%，72.19%，80.43%，87.3% 差异有统计学意义（P＜0.05）。根据这一实验思路，为明确包虫抵抗氧化应激的自我机制，以丙泊酚与过氧化氢体外诱导细粒棘球蚴原头节，观察原头节内ROS及HO-1的表达。明确包虫自我保护机制，为进行有针对性的靶向治疗提供理论基础。

图1 不同实验组之间原头节活力的变化

图2 各组药物作用后HO-1酶活性变化

图3 A：0.5 mM H2O2处理组（×100） B:1 mM丙泊酚+0.5 mM H2O2处理组（×100） C:ROS荧光强度

该实验研究显示0.5 mmol/L H2O2体外作用于原头节6 h，原头节的活力为38.0%，而使用0.5 mmol/L、0.75 mmol/L、1 mmol/L的丙泊酚分别预处理原头节8 h后加入0.5 mM H2O2，6 h后观察原头节的活力分别48.0%,58.0%和65.5%。结果表明活性氧具有明显的杀虫作用，丙泊酚抑制H2O2诱导原头节凋亡。与Gu J等在SH-SY5Y细胞内研究结果相似，因此通过探索这种保护机制进一步明确原头节的自我保护作用。通过探讨原头节自我保护的机制，有针对性的研发分子靶向药物。

外来有害物质或异物入侵机体后，主要通过两个阶段代谢过程清除异物。第一阶段为机体通过对异物的氧化、还原、羟化、水解作用使其失活。第二阶段为宿主通过激活自身的抗氧化酶GST、SOD、HO-1及NQO-1等的催化作用清除侵入机体的氧化性或毒性有害物质，防止对DNA、功能蛋白或膜脂产生损害，从而起到抗氧化、解毒及抗癌作用[13]。研究发现细粒棘球蚴原头节可以代谢H2O2[14]。因此推测原头节内存在抗氧化酶，同时参与抗氧化应激反应，并能消除活性氧从而保护自身免受氧化损伤。因此这些抗氧化酶在原头节长期寄生在人体或其他宿主体内起着关键作用[15]。在寄生虫体内，抗氧化剂（TPx）是一种重要的信号转导分子，他可以起到维持寄生虫细胞周期、能量转换和生长发育的作用[16]。研究证实，细粒棘球蚴原头节内的抗氧化剂EgTPx不仅可以帮助原头节避开宿主的免疫攻击，同时还可以保护自身抵抗由宿主代谢产生的ROS引起的氧化损伤。

该研究中，观察到丙泊酚可以抑制过氧化氢诱导原头节的凋亡，且具有浓度依赖性。HO-1活性检测显示1 mmol/L丙泊酚组HO-1表达活性明显高于低浓度组（0.5 mmol/L、0.75 mmol/L丙泊酚）。原头节内ROS水平检测发现丙泊酚浓度越高，ROS水平越低，与HO-1表达趋势相反。因此有理由推测，丙泊酚通过增加HO-1酶活性来抵抗ROS引起的氧化损伤。因此该文以HO-1相关蛋白通路为靶点，有针对性地开发抗包虫药物。