抗生素与三唑类杀菌剂混合物对羊角月牙藻的长期毒性相互作用研究

农琼媛，覃礼堂,2,3,*，莫凌云,2,3，刘勇安，梁延鹏,2,3

1. 桂林理工大学 环境科学与工程学院，桂林 541004 2. 桂林理工大学 广西环境污染控制理论与技术重点实验室，桂林 541004 3. 桂林理工大学 岩溶地区水污染控制与用水安全保障协同创新中心，桂林 541004

抗生素是人类医学史上最伟大的发现之一，它被广泛用于人类和动物感染性疾病的治疗。例如，在养殖业中，抗生素作为畜禽预防及治疗疾病的主要药物被大量使用[1]。有报道指出，约有10%～90%的兽用抗生素以原药或代谢产物的形式随粪便排放到水环境中[2]。加上我国是抗生素生产和使用大国，且滥用现象日益严重[3]，在河水、海水、地下水，甚至饮用水都检测到了抗生素的存在[4]。虽然在水环境中检出浓度通常较低，在ng·L-1～μg·L-1的浓度水平[5]，但是由于抗生素频繁使用并进入水环境中，使得抗生素在水体中持续存在，即表现出“假持续”现象，从而对整个水生生态造成长期的潜在危害，最终对人类健康造成潜在威胁[6]。四环素类和氟喹诺酮类抗生素是目前我国地表水体中检出率较高的2类抗生素，特别是土霉素(四环素类)和环丙沙星(氟喹诺酮类)的检出浓度较高[7-8]，它们的检出浓度水平为1～2 796.6 ng·L-1[9-10]。

农药是现代农业生产不可或缺的物质。大量研究表明，农药残留可能通过食物链传播，最终对人类健康构成威胁[11]。三唑类杀菌剂因具有抗菌作用及调节植物生长作用[12]，成为公认的最有效和最有前途的杀菌剂之一[13]，特别是戊唑醇，其杀菌谱较广，可用于对担子菌、子囊菌及半知菌三大亚门真菌引起的多种病害的防治，已经广泛应用于防治蔬菜、水果及花卉的病虫害[14]，它大量使用不可避免地随降雨和地表径流进入水体环境中，在地表水中检测到的浓度高达175～200 μg·L-1[15]，对水生生物及人体健康产生潜在危害[16]。研究表明，戊唑醇可能是环境内分泌干扰物[17]，在环境中残留有可能会对人类的类固醇生物合成产生一定的影响。此外，三唑类杀菌剂中的戊唑醇已经被美国环保局列入可能的人类致癌物名单[18]。

在实际环境中，水生生态系统通常暴露于多种外源化合物，抗生素和农药作为水生生物和人类频繁接触的外源化合物，可能会同时暴露[19]，且最新研究发现，抗生素的使用会提高农药的生物利用率，进而增大农药暴露的危害风险[20]。Xu等[21]报道在中国7个主要流域共检测出103种药物及个人护理品(PPCPs)和19种农药，其中包括环丙沙星、土霉素和戊唑醇3种污染物。因此，研究抗生素和农药共暴露的毒性作用具有重要现实意义。绿藻作为水生生态系统中重要的初级生产者，是反映水体环境质量的重要指标。羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)具有个体小、繁殖快和易获得等特点，且对有毒物质敏感度高[22]，已被生态环境部列为化学品风险评价的标准测试生物之一。然而，目前大多数研究者停留在对单一标准的96 h绿藻急性微板毒性测试，标准的绿藻急性毒性实验因其作用时间短，仅仅适用于快速表现出毒性的化合物的测定，对于测定影响生物生长繁殖过程的化合物的毒性，实验历经时间必须超过绿藻的世代时间[23]。单纯依据标准急性毒性实验方法获得的结果可能会严重低估或高估污染物的毒性[24]，因而延长其暴露时间能更真实地反映真实情况。由于抗生素具有络合性，在环境介质中会与农药、重金属等其他污染物共存形成复合污染物，而现有报道则多为单种或多种抗生素的试验研究[25]，涉及抗生素与农药的联合效应的研究较少，尤其关于抗生素与农药在环境水体中同时暴露对绿藻产生的联合毒性作用随暴露时间延长的变化却鲜有报道。

本文拟以2种抗生素包括四环素类的土霉素(OXY)和氟喹诺酮类的环丙沙星(CIP)及1种三唑类杀菌剂农药戊唑醇(TCZ)为研究对象，以羊角月牙藻为指示生物，采用直接均分射线法(EquRay)[26]设计3组二元混合体系，包括1组抗生素-抗生素(OXY-CIP)、2组抗生素-三唑类杀菌剂(OXY-TCZ、CIP-TCZ)。每组混合体系有5条射线，共15条混合物射线。应用浓度加和(CA)与独立作用(IA)[27]模型分析混合物长期暴露的毒性相互作用，揭示抗生素与农药在水体环境中同时暴露对绿藻产生的联合毒性作用随暴露时间延长的变化规律，为全面准确评价抗生素与农药在环境中的潜在风险提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 目标化合物

研究选取使用量较大且具有代表性的2种抗生素与1种三唑类杀菌剂。其中，土霉素与环丙沙星2种抗生素分别属于四环素类与氟喹诺酮类，戊唑醇属于三唑类杀菌剂，其理化性质详见表1。用对绿藻毒性小的体积浓度不超过5‰的二甲基亚砜(DMSO)为助溶剂溶解，储备液用Mill-Q水配制，并置于4 ℃冰箱中保存、备用。

1.2 受试生物及藻种培养

受试生物羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库(FACHB)，其编号为[FACHB-271]。选用BG11培养基[28]培养羊角月牙藻。在无菌洁净工作台中将实验用藻接种到装有新鲜培养基的250 mL锥形瓶内，然后放入人工气候恒温光照培养箱进行培养，设定温度22 ℃，光照强度约2 500～3 000 lux，光暗周期12 h∶12 h。每隔2～3 d按1∶1稀释转接藻种，在藻类细胞代谢最旺盛时期接种(上午10～11时左右)，反复接种2～3次，待藻类基本达到同步生长阶段，并处于对数生长期时，作为实验用藻。每次接种时先在显微镜下观察藻种生长情况，其生长曲线绘于图1。

图1 羊角月牙藻生长曲线注：图中( )为3个平行实验组。Fig. 1 Growth curve of Selenastrum capricornutumNote: In the figure ( ) are three parallel experimental groups.

1.3 混合物设计

为系统研究抗生素与三唑类杀菌剂混合物在长期暴露下产生毒性大小的变化规律，采用直接均分射线法(EquRay)[26]设计抗生素与三唑类杀菌剂二元混合体系，每个混合物体系共有5条射线，分别标记为R1、R2、R3、R4和R5。

1.4 绿藻毒性测试

用血球计数板测定处于对数生长期的试验绿藻的藻细胞密度，用培养基将藻液稀释，使绿藻的初始密度约为106cell·mL-1。

毒性测试以透明的96孔微孔板[29]作为测试载体，在微板四周共36个孔各加入300 μL水，防止产生边缘效应。余下60个孔的第2、6、7及11列共24个孔中是空白对照组，空白对照组加入与实验组相同含量的DMSO。第3列共6个孔以及第8列共6个孔分别加入按0.618的稀释因子设计的12个不同浓度的毒物100 μL，第4和5列为第3列的平行实验，第9和10列为第8列的平行实验，然后在除四周外的60个孔中均加入100 μL已稀释好的绿藻溶液，使各孔的试液总体积为200 μL，每个浓度至少重复3块板，盖上透明盖板密封，静置15 min，将板置于TECAN帝肯Infinite M200 Pro多功能酶标仪中测定光密度值(OD)，作为暴露时间t=0 h，然后将测完后的板置于光照培养箱中培养，将培养箱设定温度为22 ℃，光照度约2 500～3 000 lux，光暗周期12 h∶12 h；每天定时将微板交叉调换位置4次，使之均匀接受光照，分别在96、120、144和168 h测定其OD值，并由此计算对应时间点的目标污染物对羊角月牙藻的生长抑制率。

表1 目标化合物的基本理化性质Table 1 Basic physicochemical properties of the test compounds

1.5 毒性数据处理与拟合

采用两参数非线性函数Weibull(式(1))和Logit(式(2))对浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合，选择确定系数(R2)最大或均方根误差(RMSE)最小者为最优拟合函数[30]。

E=1/(1+exp(-α-βlog10(c)))

(1)

E=1-exp(-exp(α+βlog10(c)))

(2)

式中：α、β是Weibull和Logit的位置与斜率参数，E为效应即污染物对绿藻的生长抑制率，c是污染物的浓度。

1.6 混合物毒性相互作用分析

为了更加客观准确地分析混合物毒性相互作用，同时采用了参考模型CA(式(3))和IA(式(4))定性评估混合毒性[27]。观测毒性大于参考模型预测毒性称为协同作用，小于预测毒性则称为拮抗作用，若等于预测毒性则称为无相互作用或加和效应。

(3)

(4)

式(3)中：ECx,mix是混合物产生x%效应时对应的效应浓度；ECx,i为第i个组分单独存在时产生x%效应时对应的效应浓度；pi是第i个组分的摩尔浓度比。式(4)中，x%为混合物效应，fi是第i个组分的浓度-效应曲线(CRC)最佳拟合函数；Pi是混合物第i个组分的摩尔浓度比。

1.7 评估混合物相互作用

为了定量评估混合物的相互作用，基于CA与IA模型[27]，利用模型偏差比(MDR)[31]评估混合物相互作用，参见式(5)。

(5)

式(5)中：ECx,pred为某指定效应下参考模型CA或IA预测的效应浓度，ECx,obs为实验浓度。

2 结果(Results)

2.1 单一污染物对羊角月牙藻的毒性

3种目标污染物在不同时间节点的浓度-效应数据以及通过非线性函数拟合的结果列于表2中，其浓度-效应(CRC)绘于图2中。

图2 3种目标污染物对羊角月牙藻96 h与168 h的浓度-效应关系注：图中黑色散点()及空心散点()为实验点；黑色虚线()为95%的置信区间；蓝色实线()及红色实线()为拟合线。Fig. 2 Concentration-effect relationship of three target pollutants on Selenastrum capricornutume at 96 h and 168 hNote: The black scatter () and the hollow scatter () are experimental points; the black dotted line () is a 95% confidence interval; the solid blue line () and the solid red line () are fitted lines.

从表2可看出，Logit或Weibull函数能较好地拟合土霉素、环丙沙星和戊唑醇对羊角月牙藻在96～168 h的浓度-效应数据，R2均大于0.97，RMSE均小于0.03。同一污染物的半数效应浓度(EC50)在96～168 h随暴露时间的延长逐渐减小，pEC50逐渐增大，毒性大小顺序为168 h > 144 h > 120 h > 96 h。根据pEC50数值可知，在同一暴露时间点，不同污染物毒性大小顺序为OXY > TCZ > CIP。虽然污染物随暴露时间的延长，pEC50变化不明显，但是由于抗生素与农药难以遏制的滥用状况，大量持续排入环境中，时间依赖毒性不容忽视。

从图2可看出，3种目标污染物对羊角月牙藻的抑制率均是168 h>96 h。不同污染物的剂量效应变化关系不同，且毒性增加的程度不同，这表明3种污染物均具有一定的时间依赖毒性，即随着暴露时间的延长，污染物对羊角月牙藻的毒性逐渐增强。总之，168 h的毒性略大于96 h的毒性(图2和表2)。

2.2 二元混合物对羊角月牙藻的毒性相互作用

在OXY-CIP混合体系中，同一浓度比(Pi)在不同暴露时间点的CRC、CA和IA预测结果绘于图3。从图中可知，混合物的高浓度区域CA和IA预测结果均在95%置信区间上限的上方，即为拮抗作用；低浓度区域CA和IA预测结果位于95%置信区间上限和下限之间，表明混合物为加和作用；中浓度区域随着暴露时间的延长，由加和作用逐渐变成协同作用，且协同作用大小逐渐增大，在10%效应下的MDRCA与MDRIA分别增加了0.51和0.77。

在OXY-TCZ混合体系中，同一浓度比(Pi)在不同暴露时间点的CRC及CA和IA预测结果绘于图4。由图可知，暴露时间为96～168 h的高浓度区域均呈拮抗作用，低浓度区域由协同作用(96～120 h)变成加和作用(144～168 h)。在96～120 h，协同作用大小随暴露时间的延长逐渐增大，在10%效应下的MDRCA与MDRIA分别增加了1.00和1.46。

在CIP-TCZ混合体系中，同一浓度比(Pi)在不同暴露时间点的CRC及CA和IA的预测结果绘于图5。由图5可以看出，96～168 h中CA和IA的预测结果为：高浓度区域均呈拮抗作用；低浓度区域均在95%置信区间下限的下方，即为协同作用，且随暴露时间的延长，协同作用大小逐渐变大；在10%效应下的MDRCA与MDRIA分别增加了2.22和2.68。

表2 3种目标污染物对羊角月牙藻不同时间节点的浓度-效应拟合参数Table 2 Fitting parameters of concentration-effect of three target pollutants on Selenastrum capricornutum at different time points

注：α和β是Logit和Weibull函数的拟合参数；R2和RMSE分别是确定系数和均方根误差；EC50为半数效应浓度；pEC50为EC50的负对数。

Note:αandβare the fitting parameters of the Weibull or Logit function; R2and RMSE are the coefficient of determination and the root mean square error, respectively; EC50is the median effect concentration; pEC50is -logEC50.

图3 OXY-CIP混合体系对羊角月牙藻毒性的浓度-效应曲线(CRC)及浓度加和(CA)和独立作用(IA)预测结果注：图中黑色散点()为实验点；()为相互作用分界线；黑色虚线()为95%的置信区间；ANT表示拮抗作用，ADD表示加和作用，SYN表示协同作用；下同。Fig. 3 The concentration-response curves (CRCs), concentration addition (CA) and independent action (IA) predictions of mixture toxicity of OXY-CIP to Selenastrum capricornutumNote: The black scatter () is the experimental point; () represents the interaction boundary; the black dotted line () is the 95% confidence interval; ANT represents antagonism; ADD represents additive; and SYN represents synergy; the same below.

图4 OXY-TCZ混合体系对羊角月牙藻的CRC及CA和IA预测结果Fig. 4 The CRCs, CA and IA predictions of mixture toxicity of OXY-TCZ to Selenastrum capricornutum

图5 CIP-TCZ混合体系对羊角月牙藻的CRC及CA和IA预测结果Fig. 5 The CRCs, CA and IA predictions of mixture toxicity of CIP-TCZ to Selenastrum capricornutum

由以上结果可知，3组二元混合体系的毒性变化规律与单一化合物的毒性变化规律一致，168 h的毒性总是大于96 h的毒性，且随着暴露时间的延长毒性增加的程度不同。这表明抗生素与农药的联合毒性均具有一定的时间依赖毒性，即随着暴露时间的延长，其毒性逐渐增强，但不同抗生素与农药联合作用随暴露时间的延长变化规律不同。3组二元混合体系在不同暴露时间点对羊角月牙藻产生拮抗作用均出现在高浓度区域。在OXY-CIP混合体系中，低浓度区域均呈加和作用；中浓度区域随着暴露时间的延长(96～168 h)，由加和作用逐渐变成协同作用，且协同作用大小逐渐增大，在10%效应下的MDRCA与MDRIA分别增加了0.51和0.77；在OXY-TCZ混合体系中，低浓度区域由协同作用(96～120 h)变成加和作用(144～168 h)；在CIP-TCZ混合体系中，低浓度区域呈协同作用，随暴露时间的延长(96～168 h)，协同作用大小逐渐变大，在10%效应下的MDRCA与MDRIA分别增加了2.22和2.68。因此，毒性相互作用类型与浓度范围、混合物组分和暴露时间三者密切相关。

3 讨论(Discussion)

抗生素长期暴露会引起抗药菌群的出现而威胁公众健康，成为近年来环境健康领域的研究热点之一。越来越多的研究表明，部分污染物单纯依据标准急性毒性实验方法获得的结果可能会严重低估或高估污染物的毒性[24]，因而延长其暴露时间，使其检测结果能更真实地反映实际情况。而不同的污染物具有不同的时间毒性变化规律[28]。本研究发现，单一污染物168 h的毒性总是大于96 h的毒性，且随着暴露时间的延长每种污染物毒性增加程度不同；同时还发现不同混合体系随暴露时间的变化呈现的毒性相互作用类型不相同。如OXY-TCZ混合体系在120～144 h中，低浓度区域由协同作用变为加和作用；在CIP-TCZ混合体系中，低浓度区域呈协同作用的大小随着暴露时间(96～168 h)的延长，协同作用大小逐渐增大。因此混合物暴露时间是相互作用的主要影响因素之一。

不同的二元混合体系(抗生素-抗生素、抗生素-农药)呈现不同的作用类型，包括拮抗作用、协同作用和加和作用。Syberg等[32]指出，化学物质的作用模式可能随着浓度的改变而变化，即同一混合物在不同浓度区域呈现的毒性作用类型不相同。本研究也发现，对于OXY-CIP二元混合体系对羊角月牙藻的毒性相互作用，相同混合物射线(相同浓度比例)在不同浓度范围呈现不同的毒性作用类型，如OXY-CIP在高浓度区域呈拮抗作用，而中浓度区域呈协同作用，低浓度区域呈加和作用。相同的暴露时间不同混合物组分相互作用类型呈现不同的结果，莫凌云等[33]也报道不同混合物体系在同一暴露时间呈现不同相互作用结果。如在相同暴露时间144 h时，OXY-TCZ在高浓度区域呈拮抗作用，低浓度区域呈加和作用，而CIP-TCZ在高浓度区域呈拮抗作用，低浓度区域呈协同作用。因此，混合物相互作用类型与浓度范围、混合物组分有关。

抗生素与农药之间的毒性相互作用机理比较复杂，OXY-CIP、OXY-TCZ和CIP-TCZ混合体系在较高浓度区域均呈拮抗作用，在高浓度区域混合物表现出拮抗作用意味着该组混合物中，起决定作用的组分在对羊角月牙藻致毒过程中出现了不同的毒性效应或者类似竞争作用位点的可结合性降低，即“竞争性拮抗作用”[34]，从而减弱了对方的毒性。在混合体系CIP-TCZ中，低浓度区域出现协同作用的原因，可能是由于抗生素与农药(CIP-TCZ)共同存在时，绿藻的细胞膜通透性增强，污染物更容易进入细胞内，并与酶发生反应，导致吸光减弱，从而对绿藻的毒性增强[35]。藻类对不同抗生素与农药的毒性具有一定的适应性，即表现为对抗生素、农药毒性的耐受能力。然而迄今为止，有关抗生素与农药对藻类影响的研究大多局限于其单一物质对藻类急性毒性及健康风险等方面。自然水体中通常会有多种抗生素与农药共存[36]，目前有关抗生素与农药对藻类长期联合毒性研究缺乏。本文结果中混合物的协同效应的浓度水平为10～1 000 μg·L-1，而实际环境中抗生素检出浓度约为1～2 796.6 ng·L-1[9-10]，本实验所研究的浓度范围高于实际环境检出浓度，加上对于抗生素与其他农药之间的协同作用的机理解释尚未统一。因此，未来需要关注环境浓度下的抗生素与其他污染物对藻类的联合毒性效应，并从分子水平上揭示其毒性机制，这将会对地表水体中抗生素的生态风险评价提供重要的参考价值。