地塞米松对反复种植失败患者外周血Th1/Th2细胞比例失衡的调节作用

邢俊，王俊霞，王玢，孙海翔

(南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学中心，南京 210008)

IVF助孕过程中，5%～11% 的患者表现为反复种植失败(RIF)，这不仅给患者造成巨大的心理压力，同时也对生殖医学专业的医生提出巨大的挑战，成为提高辅助生殖技术(ART)成功率的瓶颈问题。反复种植失败中，免疫性因素在不明原因性RIF 中占到80%[1]。

Th(CD3+/CD4+)细胞根据分泌细胞因子不同分为Th1、Th2及Th17细胞等。其中Th2细胞分泌白细胞介素(Interleukin，IL)-4、IL-10等，参与体液免疫。Th1细胞产生干扰素(IFN)-γ、IL-2及肿瘤坏死因子(TNF)-α，介导细胞免疫和炎症反应。Th1/Th2的平衡对于成功的胚胎种植及妊娠维持非常重要，可以作为种植免疫状态的一个有效标记。对RIF患者使用免疫调节剂或者免疫抑制剂进行治疗，是改善RIF患者临床结局的一种有效方法[2-5]。长链脂肪乳、免疫球蛋白等药物可以改善RIF患者的免疫失衡，从而改善临床妊娠[6-7]。但是，目前这些治疗花费较高，且仅对部分患者治疗有效。因此，进一步寻求RIF患者的免疫治疗方案很有必要。

糖皮质激素(GC)是一种强烈的免疫抑制剂和抗炎剂，临床上广泛应用于自身免疫性疾病、过敏性疾病和移植排斥反应，它也是治疗支气管哮喘最有效的药物。在多种组织器官中，地塞米松可抑制Th1类细胞因子IL-12和IFN-γ的分泌，使其对Th2类细胞因子产生的抑制作用减弱，从而使Th1/ Th2平衡偏向Th2应答[8]。因此，我们拟对Th1比例异常升高的RIF患者行地塞米松治疗，观察其对Th1/ Th2失衡及临床结局的影响。

材料和方法

一、研究对象

选择2017年2～5月在本中心行辅助助孕后的RIF患者29例，诊断标准：本中心接受≥3个新鲜胚胎移植周期或者FET周期，且累计移植≥4枚优质胚胎而未能临床妊娠者。纳入标准：(1)年龄<40岁；(2)基础卵泡刺激素(FSH)<10 U/L；(3)经阴道B超证实双侧卵巢完整且无形态学异常；(4)甲状腺激素、血糖及胰岛素等内分泌检查正常；(5)夫妻双方染色体正常；(6)自身免疫性抗体：抗心磷脂抗体、抗核抗体、抗甲状腺抗体、抗β2-糖蛋白1抗体阴性。排除标准：(1)子宫畸形(单角子宫、双角子宫、双子宫、纵隔子宫)、子宫腺肌病、粘膜下子宫肌瘤及宫腔粘连；(2)有辅助生育技术(ART)及妊娠的禁忌证或患有对妊娠有明确影响的疾病的患者：如未控制好的高血压、心脏病、糖尿病等；(3)移植日子宫内膜厚度<7 mm；(4)遗传性易栓症。

FET周期安排时，月经周期规律、正常排卵患者采用自然周期；排卵障碍、月经不规律等患者采用雌孕激素替代周期；常规胚胎移植及黄体支持；于移植后14 d检测晨尿、 血清HCG水平以确定生化妊娠，移植后28 d超声检查见孕囊及胎心搏动，确定临床妊娠。所有患者均签署知情同意书。

二、方法

1.治疗方案及观察指标：给予RIF患者口服地塞米松0.75 mg/月，治疗前后分别用流式细胞技术检测外周血Th1、Th2细胞亚群比例。

2.流式细胞学分析：外周血中Th1(CD3+CD4+IFN-γ+/ CD4+)和Th2(CD3+CD4+IL-4+/ CD4+)细胞比例检测：取1支流式管，加1 μl刺激剂(白细胞激活剂和BD GolgiPlug)(BD Biosciences，美国)至管底，再加入月经干净后1周内抽取的50 μl外周静脉血(肝素抗凝)，震荡混匀，放37℃、5%CO2的培养箱中孵育5 h(2 h震荡混匀一次)。混匀后加入CD3 PerCP抗体和CD8 APC抗体各5 μl，避光孵育20 min。加入50 μl固定剂A(FIX & PERM试剂，Life Technologie，美国)，避光孵育15 min后加入2 ml生理盐水洗涤，1 500 rpm/5 min离心，弃去上清。加入50 μl破膜剂B(FIX & PERM试剂，Life Technologies，美国)，然后加IFN-γ FITC抗体和 IL-4 PE抗体各5 μl，室温避光孵育30 min。加1 ml生理盐水洗涤，1 500 rpm/5 min离心后弃去上清，加360 μl鞘液，混匀后上机，用FACSCanto流式细胞仪(BD Biosciences，美国)进行检测外周血中Th1和Th2细胞比例。

三、统计学分析

结 果

一、一般资料

本研究共纳入29例患者，平均年龄(31.52±0.77)岁，不孕年限(5.69±0.56)年，BMI(22.08±0.63)kg/m2，基础FSH(7.14±0.34)U/L，既往移植失败周期数为(3.41±0.19)个，既往移植胚胎数为(5.83±0.45)枚。前期我们对正常育龄期女性外周血中Th1、Th2细胞比例进行了检测分析，确定我中心外周血中Th1细胞比例正常范围为9.0%～31.0%，Th2 细胞比例正常范围为0.7%～2.6%，相关研究结果已发表[9]。

二、地塞米松治疗前、后外周血Th细胞亚群比例变化

口服地塞米松治疗后，RIF患者外周血中Th1细胞亚群比例(24.31±7.24)%较治疗前(28.60±7.59)%显著下降(P<0.05)(图1)；Th2细胞亚群比例(1.11±0.40)%较治疗前(1.08±0.39)%虽有上升，但无显著性差异(P>0.05)(图2)。

与治疗前相比，*P<0.05

图2 地塞米松治疗前、 后外周血Th2亚群比例

三、地塞米松治疗前、后外周血Th1细胞亚群比例变化

治疗前外周血Th1细胞亚群比例异常升高的RIF患者共12例，进一步观察这12例患者口服地塞米松后外周血Th1细胞亚群比例变化。结果显示，口服地塞米松治疗后该组RIF患者外周血中Th1细胞亚群比例(29.97±6.96)%较治疗前(35.66±4.36)%显著下降(P<0.05)(图3)。截至目前，此12例患者行冻融胚胎移植，6例获临床妊娠，其中5例患者已经分娩，1例患者早孕期自然流产。

与治疗前相比，*P<0.05

四、地塞米松治疗前、后外周血Th2细胞亚群比例变化

治疗前外周血Th2细胞亚群比例异常降低的RIF患者共6例，进一步观察这6例患者口服地塞米松后外周血Th2细胞亚群比例变化。结果显示，口服地塞米松治疗后该组RIF患者外周血中Th2细胞亚群比例(0.80±0.14)%较治疗前(0.61±0.09)%显著上升(P<0.05)(图4)。截至目前，此6例患者行冻融胚胎移植，3例获临床妊娠，均已分娩。

与治疗前相比，*P<0.05

讨 论

RIF是指年龄<40岁的不孕患者、接受≥3个新鲜胚胎移植周期或者FET 周期、且累计移植≥4枚优质胚胎而未能临床妊娠[10]。反复种植失败的病因很多，机制未完全明确。其中，免疫微环境紊乱是造成不明原因反复种植失败的一个重要原因。

既往研究认为Thl/Th2型细胞因子参与免疫耐受机制过程，Thl型细胞因子可影响滋养细胞侵蚀过程并抑制子宫内膜蜕膜化，并诱导NK细胞的活化、浸润，介导妊娠早期滋养细胞凋亡而致胚胎死亡；Th2型细胞因子作为免疫调节因子，能下调Thl免疫应答，从而诱导免疫耐受。Th1/Th2型细胞因子的动态平衡维持正常妊娠。在正常妊娠女性中，Th2型细胞因子IL-4及IL-10血清水平显著升高，提示正常妊娠处于Th2偏倚状态[11]。

2015年Liang等[12]发现，在体外受精促排卵周期中，成功妊娠组外周血中Th1类细胞因子TNF-α、IFN-γ的含量较未妊娠组显著下降。并且，外周血TNF-α、IFN-γ的表达量在3个时间点：GnRHa日、Gn日及HCG扳机日无显著差异，不随体内雌孕激素量的改变而改变。作者紧接着在2015年的另一篇文章中，进一步对比了34例RIF及25例首次IVF获得妊娠的IVF患者外周血的Th1、Th2类细胞因子比例，结果显示RIF患者外周血Th1类细胞因子/Th2类细胞因子IFN-γ/IL-4、IFN-γ/IL-10、TNF-α/TGF-β1比例显著升高，提示RIF患者外周血向促炎状态转变[13]。最近有学者应用Th1型细胞因子TNF-α抑制剂治疗RIF取得成功，提示Th1/Th2型细胞因子的动态平衡恢复有利于妊娠[14]。在本研究中，我们首次检测了地塞米松对Th1/Th2失衡RIF患者外周血中Th1/Th2平衡的影响。

糖皮质激素是一种强免疫抑制剂和抗炎剂，临床上广泛应用于自身免疫性疾病、过敏性疾病和移植排斥反应。地塞米松与强的松均属于临床上常用的糖皮质激素。强的松是半衰期为60 min的短效糖皮质激素，而地塞米松是半衰期达200 min的长效糖皮质激素。相较于强的松，地塞米松的抑制作用更持久[15]。Agarwal等[8]体外用地塞米松模拟人应激时血皮质醇升高后的反应，发现地塞米松可抑制IL-12和IFN-γ的分泌，使其对Th2类细胞因子产生的抑制作用减弱，导致IL-4、IL-10和IL-13分泌增多，Th1/ Th2平衡偏向Th2应答。另有报道地塞米松可逆转支气管灌洗液及大脑皮层中IFN-γ/ IL-4的比率，从而恢复Th1/ Th2平衡[16]。

糖皮质激素可作为免疫调节剂改善全身免疫环境，降低子宫自然杀伤(uNK)细胞数量，使子宫内膜细胞因子表达谱正常化，抑制子宫内膜炎症。2012年基于6项RCT研究的META分析显示，围着床期使用糖皮质激素组较未使用组可以显著提高IVF患者的临床妊娠率，但不良反应并无增加[17]。一项回顾性研究显示，自身免疫异常的IVF患者在移植前5周联合使用强的松和阿司匹林可以显著提高其临床妊娠率[18]。已经证实，对包括uNK细胞异常等的过度激活的子宫内膜免疫状态行强的松治疗可以导致更佳的临床结局[19-20]。

尽管如此，糖皮质激素对RIF患者的免疫治疗研究报道较少，效果尚未明确。对子宫内膜uNK细胞比例异常升高的RIF患者行宫腔内灌注地塞米松，可以降低uNK细胞比例，并改善临床结局[2]。对子宫内膜局部免疫过度激活的RIF患者予强的松治疗后显示，大部分患者的子宫内膜局部TWEAK表达显著上升，IL-18/TWEAK mRNA比例显著下降，提示强的松可以调节子宫内膜局部过高的Th-1/Th-2比例[21]。但是，仍有相当一部分RIF患者拒绝行子宫内膜有创检查。因此，基于外周血免疫指标检测的糖皮质激素治疗，检测微创且易于临床开展，是一个值得考虑的方法。

即便如此，对RIF患者使用糖皮质激素的应用也应当谨慎和指征明确。胚胎种植及妊娠维持需要前期的激活免疫反应及后期的免疫耐受。针对Th1过高或者过低，对不同类型的RIF患者应使用不同类型的药物治疗[13]。对所有RIF患者一概而论的使用糖皮质激素，利用其抗炎和免疫抑制效应是不合适的[22]。

本研究结果显示，地塞米松下调RIF患者异常升高的外周血Th1细胞比例，上调RIF患者异常下降的外周血Th2细胞比例，对反复种植失败患者外周血Th1/Th2细胞失衡起到再平衡的调节作用。

据报道，多种免疫调节、免疫抑制药物，比如免疫球蛋白(IVIG)、依那西普(Enbrel)、 阿达木单抗(HumiraTM)和他克莫司，可以有效改善RIF患者外周血Th1/Th2比例失衡，外周血Th1/Th2细胞比例升高的RIF患者使用上述药物后可以显著改善其临床妊娠结局，提示外周血Th1/Th2细胞比例的调整对于成功的种植和妊娠维持非常重要[3， 23-24]。外周血TNFα/IL-10比例升高的RIF患者应用免疫抑制剂羟氯喹可以显著降低外周血TNF-α水平、升高IL-10水平，改善RIF患者的免疫状态[25]。

本研究显示地塞米松可以降低RIF患者外周血Th1/Th2细胞比例，并能改善RIF患者临床结局，与文献报道相一致。因此，地塞米松或许可以作为RIF患者免疫治疗的一个候选药物。无法否认的是本研究是一项初步研究，存在某些不足，在后期工作中我们将进一步扩大样本量，通过随机对照试验进一步论证。