影响早期胚胎发育的精子因素

周建腾，马慧，张贝贝，史庆华

(中国科学技术大学附一院生殖与遗传分院 合肥微尺度物质科学国家研究中心，合肥 230027)

早期胚胎发育是一个复杂而又调控精细的过程，其异常可能导致胚胎停育、妊娠率低下、流产、死胎、早产、出生缺陷和新生儿死亡等。早期研究发现，胚胎发育主要受母源因素的调控[1-2]。但是越来越多的证据表明，精子作为高度特化的细胞类型，除了为胚胎提供父源基因组外，还参与了生殖过程中的多个生物学事件，如精卵融合、卵裂以及胚胎发育的表观调控等[3-4]。精子携带的遗传物质和表观遗传信息异常可能通过影响早期胚胎的发育而影响体外受精(IVF)结局[5](图1)。本文对精子中影响早期胚胎发育的遗传及表观遗传因素及其作用机制进行了文献综述。

DNA甲基化模式在生殖细胞发育阶段建立；减数分裂I和II期间可能发生染色体分离异常而导致非整倍体；在精子发生的最后阶段即圆形精细胞变态形成精子的过程中，鱼精蛋白替代和中心体可能出现异常；DNA碎片化则主要发生于精子中。在精子发生的整个过程中，都可能发生DNA双链断裂及修复障碍、组蛋白修饰异常和非编码RNA丰度异常(图1)。

图1 精子发生过程中遗传和表观遗传异常来源

一、父源遗传因素对早期胚胎发育的影响

1.精子染色体异常对早期胚胎发育的影响：无论减数分裂I还是减数分裂II染色体分离错误都会导致精子染色体数目异常(非整倍体)。尽管染色体非整倍精子的发生率很低，但其一旦与卵子受精后，都可能导致胚胎停育、流产、死胎等不良妊娠结局或先天出生缺陷等严重后果[6-7]。利用荧光原位杂交(FISH)可以检测精子的染色体组成[8]。研究发现，在大头畸形、多核、多鞭毛精子以及严重的少精子患者的精子中，非整倍体的发生率显著升高[9-10]。因此，在进行辅助生殖时，对精子尤其是形态异常精子或来自严重少精子症患者的精子进行染色体组成分析是必要的。另外，针对精子染色体数目异常比例偏高的夫妇，应当告知其发生流产以及后代染色体异常的风险较高。

2.精子DNA损伤对早期胚胎发育的影响：精子中的DNA损伤可能源自精子发生和成熟的不同阶段，主要类型包括DNA单链切口或双链断裂[11]。导致精子DNA损伤的因素可能有氧化应激以及精细胞变形染色质重塑时DNA断裂修复异常。氧化应激过程中会产生大量活性氧，而精子中转录失活以及细胞质很少则会导致其抗氧化活力和DNA损伤修复能力不足，进而导致DNA损伤，因此精子极易由于氧化应激产生DNA损伤[12-13]。另外，精子变形时，绝大多数组蛋白会被鱼精蛋白替代并形成高度浓缩的染色质，鱼精蛋白比例异常也会导致精子DNA损伤的增加，表明鱼精蛋白对于保持精子DNA的完整具有重要意义[14]。

检测精子DNA损伤的方法很多，如精子染色质结构分析(SCSA)、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)和单细胞电泳(Comet)分析等。研究表明，接受辅助生殖治疗的夫妇，其精子DNA损伤程度与妊娠率呈负相关[15]，与自发性流产[16]和体外培养时胚胎不能发育至胚泡阶段的比例呈正相关[17]。Schulz等[18]研究发现，来源于DNA损伤程度较高精子的胚胎往往在6～8细胞阶段发生停滞。另外，对24对复发性自发流产的夫妇进行的研究发现，其精子DNA损伤程度显著高于对照人群[16]。

尽管这些研究表明精子DNA损伤与胚胎发育密切相关，但目前尚不清楚导致胚胎发育异常的精子DNA损伤的阈值。确定不影响胚胎发育正常进行的精子DNA损伤阈值，将有助于对精子质量进行评估，并通过精子选择技术，挑选DNA损伤水平低于阈值的精子用于辅助生殖，从而提高辅助生殖成功率，降低辅助生殖技术导致后代异常的风险。

二、父源表观遗传因素对早期胚胎发育的影响

由于精子独特的功能需求，其表观修饰高度特化。在精子发生过程中，染色质上的绝大多数组蛋白被鱼精蛋白替换，形成包装紧密的精子头部，并保护精子携带的DNA不被雌性生殖道环境破坏；而未被鱼精蛋白替换的组蛋白则可以发生不同的化学修饰。此外，精子DNA则保持高度甲基化状态。这些表观修饰共同构成了精子独特的表观修饰状态。有证据表明，来自精子的多种不同形式的表观遗传信息对于哺乳动物早期胚胎的正常发育是必需的，这些修饰包括：(1)DNA甲基化；(2)组蛋白修饰；(3)染色质高级结构包装；(4)精子来源的非编码RNA(ncRNAs)。

1.精子DNA甲基化对早期胚胎发育的影响：DNA甲基化是一种重要的基因表达调控方式，它参与了基因组印记、X染色体沉默、基因的时空表达调控以及防御外源性遗传物质入侵等多个过程。启动子区域DNA甲基化水平的改变可以激活或者抑制基因转录。启动子区域的高甲基化可以阻止启动子与转录因子的结合，从而抑制这些基因表达。相反，低甲基化则可增加RNA聚合酶与DNA结合，从而促进基因的转录。

在小鼠和人等哺乳动物的生命周期中，存在两次全基因组范围的去甲基化[19]。一次是在原始生殖细胞发育过程中，全基因组中包括印记基因在内的大部分基因都发生去甲基化，抹去父母来源的印记而恢复发育多能性；另一次是在受精卵着床前早期胚胎发育过程中，即高度特化的精子和卵子，经去甲基化产生具有多能性的胚胎干细胞。着床后，早期胚胎的基因组会重新发生甲基化。

值得注意的是，受精后父源和母源基因组去甲基化是不同步的，并且父母的配子中基因组特定的区域如印记基因不会发生去甲基化，因此父源或者母源基因组甲基化水平异常可能是部分受精卵没有明显异常但着床失败的原因。Benchaib等[20]发现在IVF患者中，精子DNA低甲基化(<555 AU)与低妊娠率相关(8.3%，正常组33.3%)。在另外一项研究中，Kelly等[21]使用去甲基化剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理来降低小鼠精子DNA的甲基化水平，发现小鼠妊娠率显著下降，植入前胚胎停育比例升高。同时，DNA甲基化模式的改变也会导致印记基因表达异常，进而诱发早期胚胎发育障碍及胚胎畸形等[22]。相关研究表明，超过一半的Beckwith-Wiedeman综合征和大约10%的Angelman综合征的发生都与表观遗传缺陷有关[23]。

上述研究表明，精子DNA甲基化修饰水平对于早期胚胎发育具有重要意义，不合适的DNA甲基化会导致妊娠率下降或早期胚胎发育异常。因此，明确精子DNA甲基化和胚胎发育之间的联系，将有助于对早期胚胎发育异常相关疾病的预防和诊治。

2.精子组蛋白修饰对早期胚胎发育的影响：雄配子最独特的表观遗传特征之一是鱼精蛋白替换了组蛋白，形成高度凝集的细胞核结构，以保护其DNA不被破坏，同时维持精子的运动能力。但是，精子染色体的部分区域(1%～10%)仍保留了组蛋白及其修饰[24]。研究表明这些组蛋白保留区域不是随机分布的，而是显著富集在发育相关的位点，包括印记基因簇、小RNA簇、HOX基因簇和分散分布的发育相关转录调控因子启动子区域[25-26]。理论上，精子中的这种组蛋白及其修饰的选择性保留可以允许胚胎发育过程中特定靶基因的激活或沉默，从而调控早期胚胎发育。研究确实发现，精子中H3K4me2和H3K4me3富集的基因与胚胎发育过程密切相关，H3K27me3则富集在早期胚胎发育过程中沉默基因的启动子附近[24]。在另外一项研究中，Hammoud等[26]还发现，在导致IVF早期胚胎停育的不育男性精子中，组蛋白保留区域是随机分布的，不同于可育人群精子中保留组蛋白的分布。同时他们还发现，这些不育男性精子中与发育相关基因的H3K4me和H3K27me富集程度明显下降。这些研究表明，精子组蛋白表观遗传修饰在早期胚胎发育中具有重要作用，随着我们对精子中组蛋白及其修饰的认识的增加，将有望对男性因素所致不孕症在表观遗传学水平进行分类、诊断和治疗。

3.精子染色质高级结构对早期胚胎发育的影响：精子细胞核中染色质高级结构可能是表观遗传调控的一种方式。在精子发生过程中，鱼精蛋白会以逐步替换的方式取代染色质组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)，最终产生高度凝缩且转录沉默的染色质。圆形精细胞的染色质结构与体细胞的相似，在随后的精子成熟过程中，染色体组蛋白被高度乙酰化，并逐步被转换蛋白(TP1和TP2)替换；在精子变态的最后阶段，转换蛋白又被鱼精蛋白取代[27]。鱼精蛋白对DNA的紧密包装可以保护精子DNA免受内源和外源因子如核酸酶、自由基或诱变剂等的破坏作用[28]。精子特异的鱼精蛋白有两种，即鱼精蛋白1(P1)和鱼精蛋白2(P2)，越来越多的证据表明，P1和P2的比例可影响男性生育能力[29]。已知正常生育人群的P1/P2比率接近0.9[30]，正常范围为0.8到1.2[31]。P1/P2比率偏离这个范围的个体表现为精子功能低下，体外辅助生殖妊娠率较低，但不影响ICSI 后的妊娠率。这些结果提示，P1/P2比例的改变可能与受精过程的早期事件相关，例如精子的获能、顶体反应、质膜融合或穿透透明带等[32-33]。未来的工作中，需要进一步确定精子染色质包装异常对早期胚胎发育的确切影响。

4.精子来源的ncRNAs对早期胚胎发育的影响：成熟精子中存在多种不同类型的ncRNAs(non-coding RNAs)，包括miRNAs、PIWI-interacting RNAs(piRNAs)、tRNA-derived small RNA(tsRNAs)、mitochondrial genome-encoded small RNAs(mitosRNAs)和long ncRNAs(lncRNAs)。精子在睾丸中产生以及运输至附睾并在附睾中成熟的过程中，ncRNAs的类型和比例发生了剧烈的变化，主要表现为piRNAs的含量下降、tsRNAs的含量急剧增加[34-38]。这些非编码RNAs可以由精子携带进入卵母细胞，影响受精和早期胚胎发育。人们曾认为，与含有大量母源mRNA的卵母细胞相比，这些残留的精子ncRNAs数量太少，不可能是受精和胚胎早期发育的关键参与者[39]。然而，最近的研究表明，在早期胚胎发育过程中，精子带来的ncRNAs确实具有生物学功能[40-42]。因此，精子来源的ncRNAs被认为是从父亲传递给胚胎的另一种形式的表观遗传信息。

2016年，Chen等[43]发现精子tsRNAs可作为记忆载体将获得性状跨代传递。他们将高热量饮食处理的雄性小鼠精子的总RNAs或者tsRNAs注射入合子中，并对得到的早期胚胎及后代的胰岛进行RNA测序，发现代谢相关基因的表达显著下调。这表明精子来源的RNAs确实在早期胚胎发育过程中发挥作用。2018年，另一个研究组探索了精子成熟前后的RNA在植入前胚胎发育中的作用[4]。他们分别利用从附睾头部和附睾尾部来源的精子进行ICSI，获得了受精卵和胚胎，并考察了这些胚胎的发育情况。结果显示，使用附睾头部精子产生的胚胎在整个胚胎植入前发育过程中过度表达多种调节因子，胚胎植入率低，而且植入后胚胎快速失活。值得注意的是，在上述受精卵中，显微注射纯化后的附睾尾部特异性小RNA，不仅降低了相关调节因子的表达，还降低了植入后胚胎死亡率。这些发现说明小RNA在哺乳动物植入前胚胎发育过程中具有重要作用[4]。此外，Yuan等[41]利用Dicer和Drosha条件性敲除(cKO)小鼠获得miRNA或endo-siRNA部分缺失的精子，并考察miRNA和endo-siRNA在受精以及植入前胚胎发育中的作用。结果显示，miRNAs和endo-siRNAs谱异常的精子通过ICSI产生的胚胎，其早期发育能力降低；而注射来自正常精子的RNAs则可恢复胚胎的发育潜能。这些结果不仅表明精子携带的RNA对受精卵和植入前胚胎的发育十分重要，还提示注射正常精子来源的RNA可能是一种提高辅助生殖技术成功率的新方法。

三、精子中心体对早期胚胎发育的影响

精子的中心体是一种高度特化的细胞器，在精子成熟以及哺乳动物的胚胎发育过程中发挥重要作用[44]。在精子发生早期，与体细胞类似，精母细胞的中心体由相互垂直的两个中心粒及其附近的基质组成。精子变形过程中，远端的中心粒开始组装微管而形成精子尾部，并在精子成熟后被降解，而近端中心粒得以保留。但在卵子发生过程中，中心体则经历了完全不同的变化，卵母细胞的中心体在进入减数分裂时消失。因此，受精后，精子来源的中心粒进行复制形成正确的中心体结构，这一现象被称为中心体的不对称遗传[45]。在人类胚胎发育过程中，受精、受精卵的染色体分离和细胞分裂都依赖于精子来源的中心体[46]。

由中心体受损或缺乏的精子产生的胚胎可能表现出不同程度的发育异常。Rawe等[47]发现使用中心体形态异常或形成星状体能力下降的精子进行IVF，受精卵无法形成原核。Palermo等[44]发现，中心体不成熟可能会导致胚胎发生染色体嵌合的比例升高。使用睾丸来源的圆形精细胞获得的胚胎，发生染色体嵌合的比例高达53%，几乎是使用成熟精子获得的胚胎染色体嵌合比例(26.5%)的两倍。进一步研究发现，染色体嵌合比例的增加主要是受精卵第一次分裂时染色体分离异常导致的，而受精卵第一次分裂时染色体的分离依赖精子来源的中心体。因此，可能是睾丸来源的未成熟精子中心体功能缺陷，导致了早期胚胎有丝分裂染色体分裂异常。

尽管精子的中心体对于早期胚胎有丝分裂染色体的分离是必需的，但卵母细胞中也可能存在相应的补偿机制。冷冻可能会影响精子中包括中心体在内的蛋白质的功能，但是Liu等[48]使用冷冻后的兔子精子，利用卵细胞胞浆注射技术成功得到了后代。另一项研究中，研究人员以猪为研究模型，去除精子尾部，使用卵细胞胞浆注射技术成功得到了后代[49]，而去除尾部的精子是不包含中心体的。在这些研究中，缺少中心体的合子能进行正常有丝分裂并发育成健康的个体，目前有两种不同的猜想[50]：一是由于卵母细胞中的中心体成分组装形成具有功能的纺锤体；二是卵母细胞合成了中心体相关蛋白、完成了中心体的从头组装。高等哺乳动物为什么对中心体采用不对称遗传发生，精子中心体异常是否以及如何影响早期胚胎发育等，都有待进一步阐明。

四、总结

精子除了为胚胎提供父源的基因组外，还参与调控受精、早期胚胎发育等生物学过程。因此，进行辅助生殖时，需要全面评估精子的质量[51]。首先，精子单倍体基因组的完整性对成功生殖十分重要，使用基因组存在缺陷的精子进行辅助生殖，可能会导致妊娠率和胚胎植入率降低、胚胎发育停滞和自发流产率升高等不良妊娠结局。另外，越来越多的研究表明，精子携带的表观遗传信息在早期胚胎发育中也发挥着重要作用。精子DNA甲基化、组蛋白替换或/和修饰可以调控靶基因的表达，进而影响早期胚胎发育进程。精子染色质的高级结构不仅起到保护精子DNA的作用，还可能与受精过程如精子的获能、顶体反应、穿透透明带等相关，精子来源的中心体则可能影响早期卵裂，而精子携带的ncRNAs对早期胚胎发育的作用已逐渐明确[41]。

值得指出的是，现阶段对于精子因素与早期胚胎发育关系的研究还处于起步阶段，使用新技术、新策略和合理的实验方案来探讨精子的遗传和表观遗传缺陷与胚胎发生异常之间的关系十分必要[52-53]。首先，需要对男性不育患者进行分类，明确患者精子的遗传、表观遗传参数，确定胚胎发育状况，才能建立精子因素和胚胎发育间的直接关系。其次，还应深入探讨导致精子遗传和表观遗传异常的原因和机制。已有研究表明，环境因素和衰老是导致精子表观遗传异常的重要原因。Quintanilla-Vega等[54]报道，铅通过与鱼精蛋白2结合而影响精子染色体压缩。Yauk等[55]发现空气污染与小鼠精子的DNA甲基化水平升高有关。此外，人们也发现年龄对精子遗传物质和表观遗传信息有影响，Flatscher-Bader等[56]发现老年雄性小鼠的后代中拷贝数变异相对年轻小鼠的后代更常见，年老雄性的后代发生发育异常的比例有所升高。对衰老是否导致精子表观遗传改变仍然存在争议，但有研究表明来自老年精子的胚胎期基因表达水平等存在异常[57-58]。

总之，精子在早期胚胎发育过程中发挥了重要的作用，其遗传和表观遗传异常都可能导致妊娠率低下、胚胎发育障碍等严重问题。随着对精子和早期胚胎发育关系的研究的逐渐深入，我们可以更全面、更深入地认识哪些精子因素会影响以及如何影响早期胚胎发育，揭示精子遗传和表观遗传异常发生的原因和机制，为男性因素所致不育的预防、诊断和治疗，提供新思路。