神经肌肉电刺激对脑血管病大鼠模型神经元tau蛋白表达和氧化应激水平的影响

王玉辉 郝学喜 崔宝娟

(山东大学第二医院 1康复科，山东 济南 250033；2急诊医学中心)

神经肌肉电刺激(NMES)是利用低频电流，一般频率为25～50 Hz，刺激机体特定组织神经或肌肉，引起肌肉收缩或抽搐，进而提高肌肉功能，达到修复效果〔1〕。由于NMES其本质是作用于目标肌肉群的神经，所以应用NMES的先决条件是目标肌肉群具有完整的神经〔2〕。它常用于由于手术、外界伤害等造成的无法进行长期活动的人群，使用NMES仪进行肌肉训练，进而保持肌肉力量和质量、增加关节自主活动、促进肌肉自我良好控制，减少痉挛。近年来，除了商用的NMES仪广泛使用外，家用的NMES仪也已经被大量发展起来，目前正越来越广泛地应用于各种疾病的康复治疗中，病人方便自己独立使用。但其具体的作用机制，我们仍在不断探索中〔3〕。

脑血管病包括动脉粥样硬化、脑血栓等，由于当今社会人们的饮食环境，血稠、脑组织血液循环慢等问题暴露，逐渐造成脑组织认知功能减退等症状，疾病发展呈显著递增趋势〔4〕。尤其在老年人群中，患病率更高。有研究发现，除外界环境外，机体氧化应激是引起脑部疾病的重要影响因素之一，脑组织氧化还原系统失衡，自由氧产生过多，使缺血性损伤加重〔5〕。因此，有效干预氧化应激也是保护脑组织受损的方法之一。

tau蛋白是微管相关蛋白中含量最高的蛋白，它是神经细胞的骨架成分，参与多种细胞功能〔6〕。Tau蛋白含有磷酸基蛋白，若产生脑部疾病，其磷酸化程度加深，常表现为过度磷酸化，会使人丧失正常活动功能〔7〕。本研究旨在探讨NMES对脑血管病大鼠模型，神经无tau蛋白表达和氧化应激水平的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取健康SPF级雄性SD大鼠30只，体重(252±3.4)g，购买于北京斯贝福生物技术有限公司，由山东大学第二医院动物实验中心自养21 d。随机均分为三组:空白对照组(B组)，脑血管病模型组(C组)和NMES组(N组)，每组10只。每天正常自由饮水进食，饲喂相同饲料，所有大鼠正常活动，无疾病，适合实验。鼠房为屏障系统动物房，温度(25±2)℃，相对湿度50%～60%，每天12 h(8∶00～20∶00)照明。动物实验的操作与处理由该研究中心动物保健与使用委员会批准，符合国家实验动物伦理委员会的操作指南，遵循实验动物伦理要求。

1.2动物实验饲料 购于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心(北京)。

1.3实验方法

1.3.1脑血管病大鼠模型的建立 大鼠适应性饲养1 w，饲喂普通饲料，观察其生长情况。从第8天开始造模，腹腔注射麻醉，麻醉剂内容物为12%的水合氯醛，量控制在2.5 ml/kg，避免麻醉过深。SD大鼠经麻醉后，将大鼠俯卧放置于动物实验台上并将其固定在一个立体分类框架中。C组和N组于大鼠双侧颈总动脉采用结扎的方法建立SD大鼠脑血管病模型。术前禁食12 h，断水4 h，颈前部去毛、消毒，剪取颈正中央切口，分离双侧颈总动脉，分别用两股丝线结扎，术后送动物房饲养。造模第3天开始进行NMES治疗。N组使用NMS仪对大鼠前肢肌肉进行电刺激，频率设定100 Hz，电流5～6 mA，脉宽300 ms，1次/d，进行15 min。B组不构建脑血管病模型，亦不进行NMES治疗。实验期间检测各组大鼠体重、摄食量变化，计算脏器指数、脂肪系数和食物利用率等。每天记录给食量、剩食量和撒食量，每7 d测定一次体重。

1.3.2大鼠状态的观察 观察造模前后各组大鼠眼睛神态、毛色变化、摄食量、饮水量、排便排尿量及活动状况等变化。

1.3.3大鼠Tau 蛋白磷酸化的测定 造模第21天后，各组大鼠用12%的水合氯醛10 mg/kg进行注射，120 ml的生理盐水快速冲洗，再用偏中性的4%的多聚甲醛每只250 ml注射，随后速度减慢注射相同剂量。解剖去除脑部组织，使用4%的多聚甲醛浸泡24 h，免疫组化方法进行染色，严格按照试剂盒说明进行操作(购买于上海通蔚生物科技有限公司)，光学显微镜下进行观察。

1.3.4实时荧光定量(RT)PCR法测定mRNA相关基因表达 采用Trizol法提取大鼠脑组织总RNA，采用分光光度计法，分别在280 nm波长和260 nm波长吸光度下，计算RNA原液浓度和OD260/OD280。根据RNA原液浓度及试剂盒说明调整RNA浓度，使RNA稀释液浓度为500 ng/μl。按试剂盒要求配制反应体系，反应条件为:37℃，15 min；85℃，5 s；4℃，10 min。合成的cDNA保存于-20℃。定性分析脑组织中(PI3K)和(Akt)基因的mRNA含量〔8,9〕。设置引物序列。扩增条件：预变性 95℃ 10 min；变性94℃ 30 s；退火/延伸60℃ 1 min；融解曲线分析94℃ 15 s，60℃ 1 min，94℃ 15 s，60℃ 15 s。反应体系：前引物(5 μmol/L)1 μl，反向引物(5 μmol/L)1 μl，2×PCR 预混液10 μl，DNA模板1 μl，无酶无菌水7 μl。

严格按照试剂盒说明书进行操作，结果以2-△△Ct表示。

计算公式如下:

ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct内参基因)实验组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组。

1.3.5丙二醛(MDA)含量的测定 大鼠脑组织中MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法进行测定。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行(购自于上海通蔚生物科技有限公司)。

计算公式如下:

1.3.6超氧化物歧化酶(SOD)含量的测定 大鼠脑组织中T-SOD含量采用羟胺法进行测定。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行(购自于上海通蔚生物科技有限公司)。

政府是创新体系的主导者而非独断者，因此需要不断推进体制改革，发挥组织者的优势，优化资源配置，充分利用社会资源，为政府公共服务的创新提供最有力的支持。

计算公式如下:

定义:每毫升反应液中SOD抑制率达到50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)。

1.3.7PI3K和Akt基因蛋白含量的测定 取脑组织后加入细胞裂解液匀浆25 min，4℃，15 000 r/min离心15 min，离心后取组织上清液。严格按照二喹啉甲酸(BCA)试剂盒说明测定PI3K和Akt基因蛋白含量。PI3K和Akt检测试剂盒均购自合肥博美生物科技有限公司。每组取45 μg样品，加缓冲液使蛋白变性，跑十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将反应条带进行光密度测定，蛋白表达的相对水平为条带光密度比值。

1.4统计学方法 采用SPSS20.0软件进行方差分析及LSD-t检验。

2 结 果

2.1大鼠Tau 蛋白磷酸化表达 经测定，与B组相比，C组和N组大鼠Tau蛋白染色较明显，在C组中表现为过度磷酸化，CA1区较为明显(P<0.01)。使用电刺激治疗后，N组磷酸化程度明显减轻(P<0.01)。见表1。

表1 Tau 蛋白磷酸化表达

与对照组比较：1)P<0.05；与肺损伤组比较：2)P<0.05

表2 各组大鼠mRNA的PI3K及Akt基因相对表达量

与B组比较：1)P<0.05；与C组比较：2)P<0.05，下表同

2.3电刺激对大鼠MDA含量和SOD活性的影响 NMES对大鼠MDA含量和SOD活性进行测定。经实验测定发现，与B组相比，C组和N组MDA含量显著上升(P<0.05)，电刺激后，N组大鼠呈现下降趋势(P<0.05)，证明NMES对大鼠MDA含量有缓解的作用。N组大鼠SOD水平较B、C两组呈现显著上升趋势(P<0.05)，电刺激对抗氧化的治疗效果较好。见表4。

2.4NMES对PI3K、Akt蛋白含量的测定 通过Western印迹实验对三组大鼠PI3K、Akt的蛋白表达量及内参物GADPH进行测定。患有脑血管病显著的抑制了PI3K、Akt的表达(P<0.05)，基因下调。相比之下，电刺激后N组大鼠提高了相关基因蛋白的表达水平(P<0.05)。见图2、表5。表明N中PI3K、Akt基因与失活的C组模型大鼠相比显著被激活。

图1 RT-PCR检测基因mRNA表达情况

表3 实时荧光定量PCR引物序列

表4 各组大鼠MDA与SOD含量的影响

图2 各组大鼠PI3K、Akt基因蛋白含量的表达水平

组别PI3KAktB组1.64±0.58 1.83±0.78C组0.74±0.211) 0.85±0.331)N组1.05±0.451)2) 1.26±0.381)2)F/P值23.764/0.00126.460/0.001

3 讨 论

脑血管病发病率和死亡率正逐年上升〔10,11〕。NMES是脑部疾病康复治疗的重要手段之一，其有效利用对缓解脑血管病具有重要作用。我们通过促进脑血管病大鼠恢复肢体功能是通过刺激内源性神经干细胞增殖而进行的。其作用机制可能与刺激神经网络，增强突触效能有关〔12～14〕。

Tau蛋白是一类微管相联蛋白，具体亲水性。双股螺旋纤维丝(PHF)的主要成分是Tau蛋白，存在于正常神经元纤维中，可促进轴突对神经递质的运输〔15〕。在一个正常成年人体中，tau蛋白是主要的磷酸蛋白，蛋白磷酸化会破坏其结构，导致生物体稳态的改变〔16〕。因此，保护蛋白结构，避免磷酸化具有重要作用。而蛋白磷酸化的程度主要取决于蛋白激酶和蛋白磷酸酶之间的平衡。NMES可减轻tau蛋白的磷酸化原理是降低了蛋白激酶活性，使tau蛋白去发生脱磷酸作用，最终致使过度磷酸化的tau蛋白生产量减少或使蛋白磷酸酶的活性降低〔17〕。但是我们发现，自由基的生成使磷酸酶易被氧化，酶活性降低。此外，氧化应激还导致了晚期糖基化终末产物(AGE)的生成，AGE可以对tau蛋白进行修饰，修饰后的tau蛋白结构较稳定。因此，有效抵抗氧化应激也具有重要作用。本实验中，神经肌肉电刺激能有效清除自由基，可阻止神经细胞被自由基破坏。本研究结果说明电刺激可降低大鼠脑中磷酸化tau蛋白的水平并通过清除自由基的途径抑制氧化应激反应〔18〕。进而证实了自由基的损伤参与了神经元tau蛋白过度磷酸化的病理过程。

另外，SOD是体内氧自由基清除的一类重要的抗氧化酶，尤其在中枢神经系统中。同时是自由基清除系统的重要组成成分。MDA是脂质过氧化的最终产物，是氧自由基的重要介质可作为评价衰老的重要指标，用来反映氧自由基损伤程度的大小〔19〕。本研究结果表明，氧化应激反应也是引起神经元损伤的重要原因。二者与机体氧化还原平衡状态密切相关。但是什么导致脑血管病引起的氧化损伤的原因至今尚不清楚，还需做进一步研究验证说明。

Akt在PI3K/Akt途径中发挥着十分重要的作用，它是促细胞生存的一个重要激酶〔20〕。tau蛋白组中的Akt基因被激活，神经肌肉电刺激对脑血管病大鼠磷酸化程度有所缓解，Akt能增强GADPH的mRNA的稳定性，使GADPH在mRNA和蛋白水平均表现为抑制，可有效降低tau蛋白表达〔21〕，我们猜测其作用机制可能与抑制PI3K/Akt通路的表达有关。本研究的创新点在于首次通过电刺激在PI3K/Akt信号通路中研究神经元tau蛋白表达情况和氧化应激水平。