HPLC法测定复方小檗碱鞣酸蛋白胶囊中盐酸小檗碱的溶出度

1.贵州省食品药品检验所,贵州 贵阳 550004；2.贵阳市食品药品检验检测中心，贵州 贵阳 550004

复方小檗碱鞣酸蛋白胶囊(曾用名为泻痢朗胶囊)是贵州泛德制药有限公司独家生产的止泻药，主要用于痢疾、急慢性肠炎等[1]。现行标准为WS-10001-(HD-1111)-2002，该标准未对样品溶出度项目进行控制[2]。溶出度作为仿制药质量和疗效一致性评价的指标之一，其结果优劣对药效产生至关重要的影响，同时也能间接的反映制剂原辅料及工艺的变化情况。作者目前未查询到有关复方小檗碱鞣酸蛋白胶囊溶出度的文献报道，但查询到以盐酸小檗碱为溶出度评价指标的相关文献，测定方法主要有高效液相色谱法和紫外分光光度法[3-5]。盐酸小檗碱对多种革兰阳性菌及革兰阴性菌均有抗菌作用，对幽门螺旋杆菌有抑制作用，临床上主要用于治疗肠道感染、如肠胃炎等[6-7]。本研究中运用高效液相色谱法对复方小檗碱鞣酸蛋白胶囊进行溶出度检测，测定其所含盐酸小檗碱量，从而有效建立溶出度检查项目，为复方小檗碱鞣酸蛋白胶囊的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 SOTAX溶出试验仪(瑞士SOTAX公司)；Thermo Ultimate3000高效液相色谱仪；岛津LC-20A高效液相色谱仪； METTLER TOLEDO XS205电子天平；Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6×150 mm，5 μm)；Waters X Bridge C18色谱柱(4.6×150 mm，5 μm)；Thermo AcclaimTM C18色谱柱(4.6×150 mm，5 μm)。

1.2 试剂与试药 盐酸小檗碱对照品(110713-201814，中国食品药品检定研究院,质量分数86.7%)、醋酸钠(AR，成都金山化学试剂有限公司，20170810)、冰醋酸(AR，天津市富宇精细化工有限公司，20151002)、甲醇(HPLC,美国TEDIA,17080670)；复方小檗碱鞣酸蛋白胶囊(批号：18092012、19012011、18092021、18052012、18072011、17112011、18052011、17122011、17072012、18092011)均由贵州泛德制药有限公司提供。方法学实验样品批号为18092012。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液[0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液和0.05 mol·L-1庚烷磺酸钠溶液(1∶1)，含0.2%三乙胺，并用磷酸调节pH值至3.0]-甲醇(43∶57)为流动相；检测波长为262 nm，进样量为10 μL。理论板数按小檗碱峰计算不低于3000，盐酸小檗碱峰与相邻峰之间的分离度应符合要求。

2.2 溶出条件的优选 查阅相关文献资料，根据《中国药典》2015年版二部盐酸小檗碱胶囊溶出度的测定方法[8]，采用溶出度与释放度(通则0931第一法)，转速为每分钟120转，选取水、0.1 mol·L-1盐酸溶液、醋酸盐缓冲液(pH4.0)(取114 mL1冰醋酸用水稀释至1000 mL,取20.5 mL，再称取醋酸钠1.22 g，加水溶解并稀释至1000 mL)、磷酸盐缓冲液(pH6.6)(取磷酸二氢钠1.74 g、磷酸氢二钠2.7 g、氯化钠1.7 g与0.2 g十二烷基硫酸钠，加水使溶解成400 mL)为溶出介质[3-6，9]。在5、10、15、20、30、45、60、90和120 min取样，计算盐酸小檗碱的累积释放量，绘制溶出曲线。如图1所示。

从溶出曲线可以看出，醋酸盐缓冲液(pH-4.0)和水的累积释放量高于另外两种介质，但两种介质的累积释放量均不高，最高的只有51%(120 min)。故选取醋酸盐缓冲液(pH4.0)和水为介质，采用溶出度与释放度(通则0931第二法)，转速为每分钟120转进行比较，在5、10、15、20、30、45、60、90和120 min取样，计算盐酸小檗碱的累积释放量，绘制溶出曲线。如图1所示。

从溶出曲线可以看出，醋酸盐缓冲液(pH-4.0)是各时间点累积释放量最大的溶出介质，且满足漏槽条件，故选择醋酸盐缓冲液(pH4.0)作为溶出介质，但浆法120转的累积溶出量120 min也只有76%，故采用溶出度与释放度(通则0931第二法)，转速为每分钟150转进行实验，在5、10、15、20、30、45、60、90和120 min取样，计算盐酸小檗碱的累积释放量，绘制溶出曲线，同时比较放置沉降篮与不放置沉降篮的累积释放量。如图1所示。从溶出曲线可以看出，采用浆法150转，不放置沉降篮的是比较理想的溶出曲线。

最终选定的溶出条件为：取本品，照溶出度与释放度测定法(通则0931第二法)，以醋酸盐缓冲液(pH4.0)为溶出介质，转速为每分钟150转，依法操作，经45 min时，取溶液滤过，取续滤液作为供试品溶液；另取盐酸小檗碱对照品，精密称定，加溶出介质溶解并定量稀释成每1 mL中约含0.12 mg的溶液，作为对照品溶液。按“2.1”条下色谱条件进行试验，计算每粒中盐酸小檗碱的溶出量。限度为标示量的70%，应符合规定。

2.3 专属性试验 采用厂家提供的辅料，按处方进行称量配制阴性样品，按“2.1”条下色谱条件进行检测，阴性样品未见吸收峰；测定样品中盐酸小檗碱峰与对照溶液中的保留时间一致，盐酸小檗碱峰峰型良好，与相邻峰分离度达到要求。如图2所示。

2.4 线性 对照品储备溶液的制备：精密称取盐酸小檗碱对照品0.027 97 g置20 mL量瓶中，加溶出介质溶解并稀释至刻度，即得。

精密量取上述对照品储备溶液各0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0和5.0 mL置20 mL量瓶中，加溶出介质稀释至刻度，摇匀，即得线性溶液1到7。分别吸取线性溶液1到7各10 μL注入液相色谱仪中，按“2.1”条下色谱条件测定峰面积，记录色谱图。以盐酸小檗碱峰面积(A)为横坐标，盐酸小檗碱对照品的浓度C(μg·L-1)为纵坐标,绘制标准曲线，得盐酸小檗碱回归方程：C=1.980A+0.603(r=1)，如图3所示。表明盐酸小檗碱在30.312 5～303.124 9 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。

2.5 稳定性试验 按优选出的方法制备供试品溶液和对照品溶液，室温下分别在0、1、2、4、6、8和12 h各精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μL注入液相色谱仪中，按“2.1”条下色谱条件测定峰面积，记录色谱图,结果对照品溶液RSD为0.11%，供试品溶液RSD为0.13%。表明对照品溶液和供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.6 回收率试验 对照品贮备液的制备：精密称取盐酸小檗碱原料(含量为84.32%)0.146 2 g置100 mL量瓶中，加溶出介质溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

样品溶液的制备：按处方精密称取除盐酸小檗碱外的相当于处方量80%、100%和120%的各原辅料置100 mL量瓶中，高、中、低3种浓度各精密加入上述对照品贮备液12 mL、10 mL和8 mL。加溶出介质溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。高、中、低3个浓度样品，各平行制备3份，共9份。结果盐酸小檗碱回收率为99.36%(n=9，RSD=0.98%)。

2.7 耐用性试验 精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μL注入液相色谱仪中，按“2.1”条下色谱条件测定峰面积，记录色谱图，按外标法计算溶出量。比较了不同色谱柱、不同柱温、不同流速、不同流动相比列和不同仪器对测定结果的影响，各条件下，各色谱峰峰型良好，与相邻峰分离度均达到要求，说明该方法耐用性试验结果良好。

2.8 检出限和定量限的测定 精密称取盐酸小檗碱对照品适量，并稀释制成不同浓度的对照品溶液，精密吸取各不同浓度的对照品溶液注入液相色谱仪中，按含量测定项下的色谱条件测定峰面积，记录色谱图，以信噪比S/N≈10时的质量浓度为定量限、S/N≈3时的质量浓度为检测限。测得盐酸小檗碱的检出限和定量限分别为2.425 ng和7.275 ng。

2.9 样品溶出度测定 按优选出的溶出度方法测定10批次样品的溶出度。结果见表1。

表1 10批次样品溶出度测定结果

3 讨论

3.1 测定结果 从10批样品的测定结果可以看出，各批次样品溶出度均大于限度70%，各批次6粒测定结果RSD不大，10批次样品间RSD为5.98%，各批次间溶出行为基本一致，反应了厂家各批次间原辅料及工艺等情况控制较好，批间差异小。

3.2 滤膜吸附 实验过程中考虑到滤膜吸附对测定结果的影响，比较了两种纤维素滤头(直径13 mm,0.45 μm和直径25 mm,0.45 μm)对盐酸小檗碱的吸附影响，分别比较了去掉初滤液0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10 mL样品的测定结果，RSD分别为0.50%和0.45%，表明两种纤维素滤头对盐酸小檗碱均没有吸附。

3.3 沉降篮对溶出度的影响 本品溶出度测定结果与是否放置沉降篮有很大的关系，从图1可以看出，放置了沉降篮的样品溶出度测定值与未放置沉降篮的测定值在取样时间点盐酸小檗碱的溶出量相差约30个百分点，在测定过程中观察到，放置沉降蓝的样品在取样时样品黏附成团，一直滞留在沉降篮中，故其溶出受水流以及与搅拌桨相对位置的影响较大[10]；未放置沉降篮的样品刚投入溶出杯中时，漂浮在溶出介质中，但所有样品均在投入溶出杯中2～3 min时，囊壳崩解，内容物逐渐分散在溶出介质中，在取样时间点时，没有样品黏附成团现象，故其溶出受水流以及与搅拌桨相对位置的影响较小[10]，因此，本品在测定溶出度时不放置沉降篮较为科学合理。

3.4 结论 本文使用HPLC法对复方小檗碱鞣酸蛋白胶囊中盐酸小檗碱的溶出度进行测定，并进行了系统的方法学验证，结果表明该方法简单、准确、可靠。本研究是国家标准提升课题内容，该课题还对处方中的盐酸小檗碱和其他3种成分进行了含量控制，因此溶出度的色谱条件选择含量测定的色谱条件，方便企业及相关检验机构后续的质量监控工作，本次研究为复方小檗碱鞣酸蛋白胶囊的质量标准及产品质量的提升奠定了基础。