HPLC法测定藏药石榴莲花散中鞣花酸和胡椒碱的含量

1.甘肃省定西市药品检验检测中心，甘肃 定西 743000；2.甘肃省甘南藏族自治州药品检验检测中心，甘肃 甘南 747000；3.甘肃省甘南藏族自治州藏医医院，甘肃 甘南 747000；4.甘肃省甘南藏族自治州食品检验检测中心，甘肃 甘南 747000

民族医药学是我国传统医药的重要组成部分，藏医药是我国医药宝库中的瑰宝之一，在藏族人民的防病治病中发挥了不可磨灭的作用，以其独特的疗效越来越被大家关注。石榴莲花散由石榴子、肉桂、豆蔻、荜茇、波棱瓜子、黑冰片(炭)、诃子、蔷薇花八味中藏药材组成，具有温中健胃，消食[1]的功效，用于“培根甲布”病，积食不化，“赤巴”病，“木布”病，胃肠传染病等[2]。从藏成药发展概况及现行质量标准研究存在的局限性和相关问题、方剂理论在藏成药质量标准研究中的指导意义进行探讨。当前藏药标准体系建设相对比较滞后，导致藏药材生产、加工、管理过程不规范、不统一，优质、稳定、有效、可控的藏药材原料供给不足，严重制约了我省藏成药产业实现整体转型升级和提质增效。藏成药石榴莲花散现行质量标准收载于《卫生部药品标准(藏药第一册)》(1995年版)，但该标准中只有【性状】和【检查】项[3]，缺乏【鉴别】、【含量测定】项目，不能有效控制各组成成分的质量，从而不能有效控制藏药制剂的质量。本实验方法采用HPLC法对制剂中石榴子和诃子中鞣花酸进行含量测定，采用HPLC法对制剂中荜茇的胡椒碱进行含量测定，从而更加有效的控制藏成药石榴莲花散的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent1260高效液相色谱仪(配四元泵、自动进样器、紫外检测器)，Agilent1260高效液相色谱仪(配四元泵、自动进样器、二极管阵列检测器)，Mettler toledo MS205-DU电子分析天平，MettlertoledoEL204-IG电子分析天平，Olympus BX43 CX31光学显微镜， GT SONIC-L30超声波清洗器(广州固特超声有限公司)。

1.2 试药鞣花酸对照品(批号：11959-201602，含量以89.3%计)、胡椒碱对照品(批号：110775-201706，含量以98.9%计)均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇为色谱纯(德国默克公司)；水为屈臣氏蒸馏水；其它所用试剂为分析纯。石榴莲花散样品10批(来源：甘南藏族自治州藏医药研究院4批S1,S2，S3,S4,甘肃省夏河县藏医院3批S5，S6，S7，甘肃省碌曲县西仓寺院藏医院3批S8，S9，S10)。

2 方法与结果

2.1 鞣花酸的含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取鞣花酸对照品适量，加甲醇制成 253.2548 μg/mL的溶液，作为对照品储备液。精密吸取对照品储备液2 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，定容，即得对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取本品1.0 g，置锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理40 min，放冷，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇，稀释、定容至刻度，摇匀,取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.3 阴性对照溶液的制备 按本品处方及制备工艺制得缺石榴子和诃子的阴性样品，照“2.1.2”项供试品制备方法处理，即得缺石榴子和诃子的阴性对照溶液。

2.1.4 色谱条件与系统适用性[4-6]色谱柱：Agilent 5 HC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：乙腈-0.2%磷酸(15∶85)；检测波长：254 nm；进样量10 μL；体积流量：1.0 mL/min；柱温30 ℃。

2.1.5 专属性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪。结果表明，供试品色谱中在与对照品色谱相应位置上有色谱峰，而阴性对照色谱中在与对照品色谱相应位置上则未检测到峰，对测定结果无干扰，见图1。

2.1.6 线性关系考察 分别精密吸取上述“2.1.1”对照品储备溶液1、2、3、5mL于50 mL量瓶中，2 mL于25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取10 μL注入色谱仪，在“2.1.4”相色谱条件下测定。以峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)进行回归，得到回归方程为Y=108.45X-118.17(r=0.999 9)，5.065～25.325μg范围内线性关系良好。

2.1.7 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL注入色谱仪，按“2.1.4”色谱条件连续进样6次，测定鞣花酸峰面积，计算其RSD=0.38%(n=6),表明该测定方法精密度良好。

2.1.8 稳定性试验 取供试品溶液(样品S2)，按含量测定方法分别在0、2、4、6、8、12 h测定其鞣花酸含量。结果6次测定鞣花酸平均质量分数为0.3130%，RSD=1.29%(n=6)。结果表明，样品溶液在12 h内稳定。

2.1.9 重复性试验取 同一批样品(样品S2)，按“2.1.2”方法制备供试品溶液，共6份，按含量测定方法测定其鞣花酸含量。结果6份供试品中鞣花酸平均质量分数为0.290%，RSD=1.28%(n=6)。结果表明，该测定方法重复性良好。

2.1.10 加样回收率试验 取已知鞣花酸含量的同一批样品0.4 g(样品S2)，精密称定，平行6份，分别精密加入鞣花酸对照品储备溶液(253.2548 μg/mL)5 mL，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL注入色谱仪，在2.1.4色谱条件下测定，计算加样回收率，结果见表1。实验结果表明该含量测定方法的加样回收率符合要求。

表1 石榴莲花散中鞣花酸加样回收率试验

2.1.11 样品含量测定 取10批石榴莲花散样品，分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液。精密吸取上述供试品溶液及鞣花酸对照品溶液各10 μL注入色谱仪，在“2.1.4”色谱条件下测定鞣花酸的质量分数，结果见表2。

表2 10批石榴莲花散样品中鞣花酸、胡椒碱含量测定结果

2.2 胡椒碱的含量测定[7-8]

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取胡椒碱对照品适量置棕色容量瓶中，加甲醇制成 104.1417 μg/mL的溶液，作为对照品储备液。精密吸取对照品储备液2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，定容，即得对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备[9]精密称取本品1.0 g，置锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理40 min，放冷，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液即得供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按本品处方及制备工艺制得缺荜茇的阴性样品，照“2.2.2”项供试品制备方法处理，即得缺荜茇的阴性对照溶液。

2.2.4 色谱条件与系统适用性 色谱柱：Agilent 5 HC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：乙腈-水(40：60)；检测波长：343 nm；进样量10 μL；体积流量：1.0 mL/min；柱温30 ℃。

2.2.5 专属性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪。结果表明，供试品色谱中在与对照品色谱相应位置上有色谱峰，而阴性对照色谱中在与对照品色谱相应位置上则未检测到峰，对测定结果无干扰，见图2。

2.2.6 线性关系考察 分别精密吸取上述“2.2.1”对照品储备溶液1、2、3、5 mL于50 mL棕色容量瓶中，取2 mL于25 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取10 μL注入色谱仪，在“2.2.4”相色谱条件下测定。以峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)进行回归，得到回归方程为Y=72.128X-0.5195(r=1.000 0)，10.414～52.071μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.7 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL注入色谱仪，按“2.2.4”色谱条件连续进样6次，测定胡椒碱峰面积，计算其RSD=0.42%(n=6)，表明该测定方法精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取供试品溶液(样品S3)，按含量测定方法分别在0,2,4,6,8,12 h测定其胡椒碱含量。结果6次测定胡椒碱平均质量分数为0.121%，RSD=0.22%(n=6)。结果表明，样品溶液在12 h内稳定。

2.2.9 重复性试验 取同一批样品(样品S3)，按“2.2.2”方法制备供试品溶液，共6份，按含量测定方法测定其胡椒碱含量。结果6份供试品中胡椒碱平均质量分数为0.119%，RSD=0.58%(n=6)。结果表明，该测定方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验 取已知胡椒碱含量的同一批样品0.4 g(样品S3)，精密称定，平行6份，分别精密加入胡椒碱对照品储备溶液(104.1417 μg/mL)5 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL注入色谱仪，在“2.2.4”色谱条件下测定，计算加样回收率，结果见表3。实验结果表明该含量测定方法的加样回收率符合要求。

表3 石榴莲花散中胡椒碱加样回收率试验

2.2.11 样品含量测定 取10批石榴莲花散样品，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。精密吸取上述供试品溶液及胡椒碱对照品溶液各10 μL注入色谱仪，在“2.2.4”色谱条件下测定，结果见表2。

3 讨论

方法选定过程中，石榴莲花散方中8味药，石榴子为主药，通过查阅大量文献资料显示，石榴子中主要特征成分有石榴酸，鞣花酸等，但石榴酸是共轭三烯酸，其性质不稳定，存在同分异构体，易氧化成醛、酮、酸、醇和环氧化物等易挥发的小分子物质，且已有大量文献研究采用HPLC法测定石榴籽中鞣花酸等鞣质成分的含量[10]，色谱条件成熟，诃子中主要特征成分也有鞣花酸，故本实验选择研究具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗病毒等药理作用的鞣花酸为对照，进行其含量测定，制定其质量标准。本实验用甘南州藏医院提供的单味药材模拟石榴莲花散配方制成自配样，用建立的实验方法测定自配样和石榴子、诃子单味中的鞣花酸含量，结果表明，自配样中鞣花酸含量为石榴子和诃子单味中的总和。因此考虑建立高效液相色谱方法同时测定石榴子与诃子中鞣花酸的含量 。

过程中应注意，荜茇中主要活性化学成分是胡椒碱，其具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等作用。胡椒碱对光十分敏感，易发生光化学歧化作用产生异构体。因此本实验采用高效液相色谱法测定荜茇中胡椒碱的含量时，在取样后加入溶媒超声提取、过滤、稀释等实验操作过程中要特别注意避光，以确保实验结果的准确性。

实验中采用二极管阵列检测器对被测成分鞣花酸、胡椒碱的纯度进行了验证，结果与对照品光谱图一致，说明被测峰基本为单一物质。

本实验供试品溶液的制备方法中，供试品超声提取时间的选择试验了30 min、40 min、50 min，超声时间30 min的待测成分含量较低，超声时间40 min和50 min的待测成分含量较高，且相差不大，表明超声40 min待测成分已基本提取完全，因此选择超声提取时间为40 min。

综上，在现有试验条件下，本实验建立的高效液相色谱法测定鞣花酸和胡椒碱含量的方法，供试品制备前处理操作简便，结果准确、重复性好，专属性高，结果可靠，可有效控制藏成药石榴莲花散的质量。