肝源性糖尿病患者肝组织干扰素诱导蛋白-10表达变化*

张 梅，石秀英，李林娟，薛亚妮

肝脏作为糖代谢的重要器官，在肝功能损害时会导致体内糖原代谢异常或是肝源性糖尿病的发生。国外学者研究显示，大约有50%～80%慢性肝病患者有糖耐量异常，而且患者直接发展为糖尿病的比例大约是20%～30%[1]。持续的血糖浓度升高会对肝细胞造成损害，严重时会引发肝衰竭，威胁患者生命[2]。干扰素诱导蛋白-10（interferon-inducibe protein 10，IP-10）是一种炎症趋化因子，相关研究认为其具有重要的生物学功能，包括抗病毒免疫、抗肿瘤、抑制血管新生，并在各种炎症因子介导的疾病发生发展过程中具有重要的作用[3，4]。本研究检测了肝源性糖尿病患者血清和肝组织IP-10水平或表达情况，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2016年3月～2018年5月我院诊治的乙型肝炎肝硬化并发肝源性糖尿病患者70例，男40例，女30例；年龄38～65岁，平均年龄为（46.3±7.5）岁。乙型肝炎肝硬化患者70例，男37例，女33例；年龄37～62岁，平均年龄为（45.9±6.1）岁。诊断依据中华医学会肝病学分会和感染病学分会修订的《慢性乙型肝炎防治指南》[5]的标准，并符合肝源性糖尿病的诊断标准，即，①在糖尿病发生前有肝病史，或同时发生；②肝功能异常；③无糖尿病史及糖尿病家族史；④空腹血糖≥7.0 mmol/L，餐后2 h血糖≥ 11.1 mmol/L；⑤空腹胰岛素水平偏高，餐后胰岛素反应不良。排除标准：因患有肾上腺或垂体疾病出现的血糖升高等糖代谢异常、由药物摄入造成的糖代谢紊乱，包括糖皮质激素等、伴有心、脑、肾和其他器官严重功能不全者。

1.2 血清IP-10水平检测 采用ELISA法，所有患者在空腹状态下采集静脉血5 mL，分离血清，使用Alies全自动酶标仪和美国西格玛奥德里奇公司提供的试剂检测，根据试剂盒说明书绘制标准曲线，获得IP-10水平。

1.3 肝组织IP-10 mRNA水平检测 常规行肝穿刺，取肝组织5 mg，根据说明书要求进行总RNA提取。取RNA1μl，加入DEPC水，稀释比例为1:250，在紫外分光光度剂下检测RNA浓度和纯度，取A260/A280比值范围为1.8～2.0的样品，进行试验。取RNA 8 μl，逆转录合成cDNA（合成试剂盒由上海生工生物公司提供）。检测IP-10和甘油醛－3－磷酸脱氢酶（GAPDH）的引物序列见表1。在PCR反应体系中加入IP-10或GAPDH特异性引物，在一定的温度参数下进行扩增。

1.4 肝组织IP-10蛋白表达检测 采用SP免疫组化法，取经10%福尔马林固定的肝组织，石蜡包埋（华利电子有限责任公司提供的ZMN-7803组织包埋机），切片，常规脱蜡脱水，切片（德国徕卡有限公司提供的LEICARM 2128切片机）。使用3%过氧化氢去离子水温育10～30 min，灭活内源性过氧化物酶活性。取出切片，放入蒸馏水中洗涤。PBS浸泡5 min，常规封闭后室温孵育10 min，滴加一抗工作液于组织片上，37℃孵育1～2 h，用PBS缓冲液反复清洗3次，滴加二抗工作液于组织片上，37℃孵育10～30 min，用PBS缓冲液清洗3次，每次5 min，接着滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，孵育后冲洗。滴加DAB（福州迈新生物技术开发公司）显色3～15 min，加入底物显色。在显微镜下，采用双盲法观察，发现深褐色着色者提示为阳性，计算阳性细胞百分率。

表1 PCR反应引物序列及其反应条件

1.5 统计学分析 应用SPSS 22.0统计软件分析，计量资料以（±s）表示，采用 t检验，计数资料的比较采用x2检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清和肝组织IP-10水平比较 乙型肝炎肝硬化并发肝源性糖尿病血清和肝组织IP-10水平显著高于不伴糖尿病的肝硬化患者，差异具有统计学意义（P＜0.01，表1）。

表2 两组血清和肝组织IP-10水平（±s）比较

表2 两组血清和肝组织IP-10水平（±s）比较

例数 血清 IP-10（pg/mL）糖尿病 70肝硬化 70 t值P值236.59±28.30 205.31±26.92 6.701＜0.001肝组织IP-10 mRNA（lgcopies/ml）0.59±0.91 0.21±0.66 2.828 0.005

2.2 肝源性糖尿病患者肝组织IP-10表达情况 乙型肝炎肝硬化并发糖尿病患者肝组织IP-10阳性率为31.4%，显著高于不伴糖尿病患者的12.9%，差异具有统计学意义（x2=7.002，P＜0.05，图 1、图 2）。

图1 肝源性糖尿病患者肝组织IP-10表达情况（SP，100×）

图2 肝源性糖尿病患者肝组织IP-10表达情况（SP，40×）

3 讨论

肝脏是人体糖代谢的重要调节器官，在葡萄糖代谢过程中发挥着重要的作用，可对血糖进行调节[6，7]。一般而言，人们进餐后血糖水平会上升，小肠吸收血糖后接着会运输到肝脏，进行肝糖原合成。当血糖水平下降时，所贮存的糖原会进一步分解成游离葡萄糖，促使血糖水平恢复。所以，各种因素引起的肝功能损伤会使得肝脏对糖的调节能力下降，导致血糖水平上升或是下降，难以维持正常水平，严重的可导致机体糖耐量明显降低，以至于引发肝源性糖尿病[8，9]。慢性肝病患者胰岛素分泌和代谢障碍、细胞因子和炎性因子等多方面因素在糖代谢紊乱的发生过程中发挥着重要的作用[10，11]。淋巴细胞可对胰岛β细胞造成一定的损伤。然而，现如今关于淋巴细胞由血液迁移到胰岛炎症部位的机制还没有得到一致的结论，有待于进一步阐明[12，13]。IP-10是上世纪80年代中期发现的CXC类炎症趋化因子，由干扰素γ（IFN-γ）诱导产生，能够趋化高度表达CXC受体3（CXCR3）的多种炎症细胞，特别是淋巴细胞而到达炎性部位[14，15]。IP-10可以被IFN-γ所诱导，主要由Th l细胞介导的免疫反应所诱导。相关学者研究认为，外周血Th l细胞因子在糖尿病的发生发展过程中起到了重要的作用,而其中代表性因素就是γ-干扰素。对于慢性乙型肝炎患者来说，γ-干扰素可以显著提高其免疫活化能力，减小炎症对机体的病理性损伤[16，17]。在肝脏内，肝细胞可产生IP-10，并与CXCR3相互作用，以此趋化单核巨噬细胞、激活NK细胞和T淋巴细胞，启动多种炎性细胞因子，加重肝细胞损伤，抑制血管新生。

国外学者通过IL-1β、INF-γ和dsRNA刺激体外培养的小鼠细胞和人的胰岛β细胞，采用RT-PCR和ELISA法测定出高水平的IP-10，说明炎症性细胞因子可以刺激胰岛β细胞分泌IP-10高表达[18，19]。应用病毒攻击，也可获得类似的结果。乙型肝炎病毒作用也与肝源性糖尿病的发生密切相关，其中乙型肝炎病毒感染后会引起肝功能受损，进而造成糖代谢失去平衡，并且乙型肝炎病毒可直接损害胰腺的胰岛组织，引起腺泡炎症和坏死，胰岛细胞功能失调，使得胰岛素的分泌减少，引起血糖升高[20，21]。国外学者研究认为，丙型肝炎病毒感染者糖尿病的发生率较高[22]。丙型肝炎病毒容易在肝外组织复制，损伤胰岛细胞，减少胰岛素的分泌，并且该病毒核心蛋白能够诱导细胞因子信号转导抑制因子3（SOCCS3）的产生，进而影响胰岛素信号的传递；同时引起胰岛β细胞的凋亡，引发胰岛素抵抗。为此，清除丙型肝炎病毒RNA可以增加胰岛素敏感度，使胰岛素水平维持在正常范围内。而且，对于肝炎患者而言，定期检查HBV DNA和HCV RNA载量是有必要的。在49例慢性乙型肝炎患者和同期选择的正常健康人，检测血清IP-10水平，结果显示慢性乙型肝炎患者血清IP-10水平明显高于健康人，差异具有统计学意义[23]。慢性乙型肝炎患者肝损伤程度与血清IP-10水平密切相关，慢性乙型肝炎中重度肝损伤患者血清IP-10呈高水平，提示乙型肝炎病毒感染人体肝脏组织后会产生炎症反应。当炎症发生时IP-10水平明显增加，以更好地对各种炎性细胞发挥趋化作用，呈现出抗病毒效应，但也会促使患者肝脏组织损伤程度进一步加重。研究发现HBeAg阴性患者血清IP-10水平明显低于HBeAg阳性患者，提示乙型肝炎病毒复制活跃程度可能在一定程度上影响了血清IP-10水平。在肝源性糖尿病患者，病毒基因通过抑制真性胰岛素生成，造成胰岛素抵抗，以至于发生了免疫损伤[24-27]。所以，IP-10可能参与肝源性糖尿病的发生发展，但能否作为评估肝源性糖尿病病情及患者预后的指标尚需深入探讨。

本研究结果显示，采用ELISA法检测糖尿病患者血清IP-10水平，发现伴有糖尿病的肝硬化患者血清IP-10水平显著高于不伴有糖尿病的肝硬化患者，前者肝组织IP-10 mRNA水平也明显升高，肝组织IP-10表达阳性率明显高于不伴有糖尿病的肝硬化患者,提示检测血清和肝组织IP-10表达，对研究肝源性糖尿病的发生机制，尤其是炎性反应在其中的作用，可能有帮助。

综上所述，伴有肝源性糖尿病的乙型肝炎肝硬化患者肝组织和血清IP-10水平升高，暗示IP-10高表达可能通过炎症机制参与了肝源性糖尿病的发生，但本研究未分析肝组织IP-10表达与临床指标的关系，也不知道这种高表达对患者治疗应答和预后有何意义，仍需进一步研究。