灯盏花素对肝脏缺血再灌注损伤大鼠肝脏和肠黏膜屏障功能的保护作用*

林秋香，王雪雯，黄祖雄，潘 晨

缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是指组织在一定时间内缺血，恢复供血后组织受到损伤加重的现象[1]。在大多数情况下，动物器官缺血后再灌注可以使得组织器官功能得到恢复，受到损伤的结构也得到恢复，但肝脏缺血一段时间后重新恢复血流会发生损伤进一步加重的现象。研究表明能量代谢障碍、氧自由基的产生、细胞内钙超载、中性粒细胞活化并释放炎性细胞因子等均为影响IRI程度的重要因素[2]。灯盏花素（erigeron breviscapus）又名灯盏细辛，主要有效成分为黄酮类[3，4]。经过成分鉴定，灯盏花素中的灯盏乙素含量约为95%，主要从短亭飞蓬中提取而来。有研究表明，灯盏花素可以有效减少血小板凝聚、改善心脑血管血流量、抵抗自由基的氧化作用[5，6]。灯盏花素可以有效地保护肝脏，其主要机理为其能清除氧自由基、降低血浆纤维蛋白原含量和促进纤溶酶活性，改善微循环。灯盏花素对肠IRI有明显的保护作用，主要是其能改善肠粘膜微循环障碍，从而能保护肠黏膜屏障功能[7，8]。本研究观察了灯盏花素对大鼠肝脏IRI和肠黏膜屏障功能的保护作用，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级6周龄雌性大鼠45只，体质量为200±30 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号为SCXK（京）2017-0022，普通级，分9笼饲养于本院动物中心实验室。总一氧化氮（NO）检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 肝脏缺血再灌注损伤模型的制备[9]随机将大鼠分为对照组、模型组和灯盏花素干预组，每组15只。术前3 d，给予模型组和对照组动物生理盐水5 ml·kg-1经尾静脉注射，在灯盏花素干预组，给予灯盏花素5 mg.·kg-1尾静脉推注。给予模型组和灯盏花素处理组大鼠3%戊巴比妥钠30 mg·kg-1腹腔注射麻醉，正中切口进腹，解剖肝门，用无创动脉夹夹闭肝脏左、中叶门静脉和肝动脉分支，制造约70%肝脏缺血模型。60 min后，松开动脉夹，进行再灌注120 min；在对照组，以相同的手术方法切开显露门静脉和肝动脉，但不夹闭血管。参照前期研究，制备肠I/R模型[10]。在模型组大鼠和灯盏花素干预组，给予10%水合氯醛溶液3.5 mL·kg-1腹腔注射麻醉，手术、分离肠系膜上动脉（SMA），使用微动脉夹，造成肠缺血模型，45 min后松开动脉夹，进行再灌注 60 min。

1.3 血浆内毒素检测 取大鼠血浆100μL，严格按照ELISA试剂盒（美国Sigma公司）说明书操作步骤检测。

1.4 大鼠肠黏膜分泌型（S）IgA及肠组织诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）、内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）、NO、TNF-α和IL-1β水平检测 刮取肠黏膜，溶于PBS（pH 7.4）2 mL中制成悬液，采用ELISA 法（购自美国R&D Systems公司）检测SIgA水平。取大鼠肠组织，溶于PBS（pH 7.4）2 mL中制成悬液，采用ELISA检测NOS（上海仁捷生物科技有限公司）、NO（上海齐一生物科技有限公司）、TNF-α和IL-1β（武汉华联科有限公司）。

1.5 肠黏膜屏障功能检测 取大鼠静脉血2μL，2000 r/m离心后，吸收上层血清，采用化学发光法检测血清降钙素原（PCT）水平（试剂盒购自武汉佰奥达生物科技有限公司）；采用活性比色法检测血清二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）水平（ 试剂盒购自厦门慧嘉生物科技有限公司）。

1.6 大鼠肝组织Toll样受体-4（TLR4）和核因子（NF）-κB表达水平检测 采用Western blot法，以β-actin为内参，应用Imagaquent 5.1软件对蛋白质条带灰度进行相对定量分析。以TLR4和NF-κB蛋白条带与 β-actin灰度比值表示蛋白相对表达水平。

1.7 统计学方法 应用SPSS 22.0软件处理和分析，计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肠粘膜SIgA和血浆指标比较 与对照组比，模型组大鼠肠黏膜SIgA含量显著下降（P＜0.01）；大鼠血浆内毒素、PTC和DAO水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比，灯盏花素干预组大鼠SIgA含量显著升高，而内毒素、PTC和DAO水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01，表1）。

表1 大鼠肠粘膜SIgA、血浆内毒素、PTC和DAO水平（±s）比较

表1 大鼠肠粘膜SIgA、血浆内毒素、PTC和DAO水平（±s）比较

与对照组比，①P＜0.01；与模型组比，②P＜0.01

DAO（Ku/L）对照组 0.7±0.1 0.2±0.1 3.5±0.98 6.5±1.2模型组 0.2±0.1① 0.8±0.1① 5.0±1.2① 10.5±1.6①灯盏花素 0.7±0.1② 0.3±0.1② 3.9±1.0② 7.5±1.3②SIgA（μg/kg）内毒素（EU/ml）PTC（ng/ml）

2.2 大鼠肠组织iNOS、eNOS和NO水平比较 与对照组比，模型组大鼠肠组织iNOS含量显著上升，差异有统计学意义（P＜0.01），而eNOS和和总NO含量显著下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比，灯盏花素干预组大鼠肠组织iNOS含量显著下降，差异有统计学意义（P＜0.01），而eNOS和总NO含量显著上升，差异有统计学意义（P＜0.01，表2）。

2.3 大鼠肝组织TLR4和NF-κB及血浆TNF-α和IL-1β水平比较 与对照组比，模型组大鼠肝组织 TLR4和 NF-κB及血浆 TNF-α 和 IL-1β水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比，灯盏花素处理组大鼠肝组织 TLR4和NF-κB及血浆TNF-α和IL-1β水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01，表3）。

表2 大鼠肠组织iNOS、eNOS 和NO 水平（±s）比较

表2 大鼠肠组织iNOS、eNOS 和NO 水平（±s）比较

与对照组比，①P＜0.01；与模型组比，②P＜0.01

iNOS（U/g） eNOS（U/g） NO（μmol/g）对照组 0.2±0.1 0.4±0.1 0.4±0.0模型组 0.7±0.1① 0.2±0.1① 0.2±0.1①灯盏花素 0.3±0.1② 0.8±0.2② 0.8±0.1②

表3 大鼠肝脏组织TLR4、NF-κB及血浆TNF-α和 IL-1β（±s）比较

表3 大鼠肝脏组织TLR4、NF-κB及血浆TNF-α和 IL-1β（±s）比较

与对照组比，①P＜0.01；与模型组比，②P＜0.01

IL-1β（mg/g）对照组 0.3±0.1 0.5±0.1 10.2±1.2 0.5±0.1模型组 1.3±0.2① 1.3±0.2① 15.5±1.1① 1.3±0.1①灯盏花素 0.3±0.1② 0.7±0.1② 11.8±0.2② 0.6±0.1②TLR4 NF-κB TNF-α（pg/ml）

3 讨论

由于肝脏缺血再灌注后肝功能反复出现异常，会使得肠道系统存在慢性炎症反应，导致肠黏膜屏障保护功能受到严重影响，渗透性程度明显增加，阻隔内毒素的功能显著性降低。当肠道内毒素水平过高会导致内毒素血症，进一步加重肝功能损害和肠黏膜屏障功能紊乱的严重程度[11]。本研究发现使用灯盏花素处理后大鼠血浆内毒素水平显著降低，说明灯盏花素可以有效缓解大鼠肠道损伤。有研究表明[12，13]，eNOS催化产生的NO对肠黏膜屏障功能有保护作用，缺血再灌注损伤会促使炎症反应，诱导iNOS表达增加，导致NO合成增加，在这种情况下iNOS催化产生的NO被认为对肠黏膜屏障功能有损伤作用。有研究发现[14-16]，肠黏膜屏障功能损伤后，大量NO与超氧化物自由基反应产生过氧亚硝酸盐，并发生亚硝化反应，促使NO含量增加，加重缺血再灌注对肠黏膜屏障功能的损害。灯盏花素处理可激活eNOS/NO通路、增加肠黏膜SIgA表达、使得大鼠血浆内毒素含量减少，减轻肠黏膜损伤[17]。本研究发现在使用灯盏花素处理后，大鼠肠黏膜SIgA和体内内毒素显著降低，说明灯盏花素有效地改善了肠黏膜屏障功能。大鼠体内eNOS/NO含量也显著上升，说明灯盏花素有效地激活了eNOS/NO通路，达到对肠黏膜屏障功能的保护作用，这与先前的研究结论相一致。

PCT是无生理学活性功能的降钙素前肽。当肠黏膜屏障保护系统受到严重损害时会促进内毒素的分泌和释放，这些内毒素会导致 PCT合成分泌量迅速升高，使得血清 PCT平显著性升高。血浆PCT水平可准确反映肠黏膜屏障功能损伤的严重程度[18]。DAO则是一种肠黏膜上皮细胞内酶，肠黏膜上皮受到严重损害时，会分泌DAO并释放入肠间隙和血液循环系统，导致血浆DAO水平显著升高，故DAO水平可准确反映肠黏膜组织结构和生理功能状态[19]。本研究发现使用灯盏花素处理后，大鼠血浆PCT和DAO水平显著降低。

NF-κB是一种真核转录因子，其作用和分布都十分广泛，有研究表明其参与各种炎症反应和免疫调控[20]。在肝脏缺血再灌注过程中NF-κB调控的炎症因子有TNF-α、IL-1β、IL-1和IL-6等。灯盏花素预处理可以通过抑制NF-κB的表达，下调炎症因子分泌，达到缓解肝脏IRI的加重。TLRs是近年发现的一类模式识别受体（pattern recognition receptor），主要有 TLR1-TL9，其中 TLR-4 主要存在于肝脏细胞，是一种跨膜蛋白。有研究表明，TLR-4含量的增加会使IRAK4磷酸化，激活TRAF6，导致NF-κB活化，促使 TNF-α、IL-1β、IL-1和 IL-6表达，加重肝脏IRI。本实验发现，在使用灯盏花素处理的大鼠，体内NF-κB显著下降，相应的炎症因子含量也显著下降，有效地缓解了大鼠肝脏IRI。本实验还发现灯盏花素处理组大鼠体内TNF-α和IL-1β含量显著下降，这一结果也证明了药物处理大鼠体内NF-κB和TLR-4含量确实下降了，因而肝脏缺血再灌注损伤也得到了显著的改善。